流式细胞仪操作规程.docx

流式细胞仪操作规程目录1:淋巴细胞亚群测定及绝对计数2：活化淋巴细胞亚群、记忆T及纯真T的检测3： HLA-B27 测定CD55 / CD59 测定 5：干细胞检测和绝对计数6：白血病免疫分型测定 7：淋巴细胞T细胞亚群细胞内因子IFN- Y /IL-4测定8：细胞周期分析活化血小板检测 10：血小板抗体测定11：红细胞抗体测定12：粒细胞抗体测定淋巴细胞亚群测定（流式细胞仪）医院检验科操作规程文件号：200_年_月_日起实施第1版供3页）本规程每2年复审一次复审日期：年 月 日复审人： 规程编写者：审批者：批准日期：年 月 日文件分发部门和/或个人院档案室保管者：检验科主任：检验科 实验室：淋巴细胞亚群测定方法流式细胞仪（BeckmanCoulter，贝克曼库尔特） 原理：双/三色/四色直接免疫荧光法荧光素标记的各种单克隆抗体加入到全血中， 与白细胞膜上相应的抗原结合，经过溶血、洗涤（和固定）等步骤后，在流式 细胞仪上进行分析，从而得到淋巴细胞亚群的百分数，加入Flow-Count即可 得出绝对计数淋巴细胞表面抗原分布如下：T淋巴细胞：CD3+； B淋巴细胞： CD3-，CDl9+ ；辅助性T淋巴细胞：CD3+CD4+；抑制性T淋巴细胞：CD3+CD8+； NK细胞：CD3-CDl6+56+等。

根据淋巴细胞膜上CD分子表达的不同，流式细胞 仪可以分辨出淋巴细胞及其各种不同的亚群，利用计算机软件计算出淋巴细胞 亚群的百分数，加入 Flow-Count 组会 自动得出绝对计数标本采集与处理受检者的准备 检查对象生活饮食处于日常状态采集部位 静脉采血抗凝剂 EDTA或肝素抗凝血要求 1.样本量1ml2. 样本应在采集后6小时内处理，冷冻或溶血的标本不能用3. 样本白细胞计数应在之间若＞X109/L， 样本 需要稀释，用PBS稀释；若＜X109/L，应分离单个核细胞试剂品牌 剂型 规格 贮存贝克曼库尔特成分1：单克隆抗体 液体 2—8°C（CD45/4/8/3 CD45/56/19/3CD4/8/3 同型对照 IgG1/IgG1/IgG1CD3/19 CD3/16+56 CD19-PC5Flow-Count荧光微球2：全血溶血试剂（Q-Prep）液体A：甲酸液体70ML室温B：碳酸钠等液体32ML室温C：多聚甲醛液体14ML室温(Optilyse C 液体室温3：鞘液 液体20L室温4：清洗液液体5L室温5：荧光微球液体 10ML 2-8C (Flow-Check)仪器BeckmanCoulter EPICS XL/FC500/Altra样本制备：1） 按照要求，分别向已编好号的试管中加入10/20 ul单克隆抗体和同型对照2） 分别向试管中加入混匀的100u1抗凝血。

3） 混匀，避光，室温孵育20-30分钟4） 溶血：a. OptiLyse C（按说明书步骤溶血）b.使用COULTER Q—PREP制备系统开机---显示READY灯亮---选择35SEC灯亮---开门---放入试管 关门 自动进行溶血 显示READY灯亮 开门 取出试管 ---再进行下一个样品测定溶血前确认A/B/C管路充满并能打出液体）5） 上机测样（可根据样本情况选择洗或不洗上样）6） 需要做绝对计数的指标，在相应管中加入与血样等量的Flow-Count（务必做 到三同：同枪，同人，同种方法加Flow-Count，而且加完即上机）报告结果报告百分数（和绝对值）操作性能精密度 批内五次重复CV<2 %参考值（百分数（绝对值））CD3+ CD4+ CD8+ NK （175-567）Th/Ts临床意义、B淋巴细胞亚群是重要的免疫状态检测指标，在肿瘤、免疫缺陷、病毒感染，自身免疫性疾病、创伤、急性感染、多脏器功能衰竭、器官移植等具有临床 诊断、病情判断、治疗等价值临床常用Th / Ts比值来判断病人的免疫状况Th/Ts比值升高：表示免疫功能亢进：见于自身免疫性疾病，如SLE、类风湿 性关节炎、自身免疫性溶血性贫血、重症肌无力以及HBsAg+乙肝等。

Th/Ts比值减低：表示免疫功能下降：艾滋病、病毒感染、肿瘤病人、慢活肝 和活动性肝硬化、再生障碍性贫血、粒细胞减少患者2： NK细胞主要破坏各种肿瘤细胞和感染某些病毒、细菌的细胞，所以在抗肿瘤和 防御疾病中起主要作用°NK活性减低主要见于各种恶性肿瘤、自身免疫性疾病、 病毒感染、应用免疫抑制剂，疲劳综合征病人等，NK活性随年龄增长而减退NK细胞也参与第二型超敏反应和移植物抗宿反应，白介素-2治疗后；外周血NK 细胞增加方案（Protocol）1.选参数点击4色3色点击点击（命名，点击save）2.画图填写Flow-Count的浓度活化淋巴细胞亚群、记忆T及纯真T的测定方法流式细胞仪（BeckmanCoulter，贝克曼库尔特）原理：双/三色直接免疫荧光法荧光素标记的各种单克隆抗体加入到全血中，与白 细胞膜上相应的抗原结合，经过溶血、洗涤（和固定）等步骤后，在流式细胞 仪上进行分析，从而得到相应各亚群的百分数活化淋巴细胞表面抗原为 CD3+/CD25+和 CD3+/HLA-DR+CD3+/CD45RO+是记忆型 T 细胞CD3+/CD45RA+ 是纯真型T细胞标本采集与处理受检者的准备 检查对象生活饮食处于日常状态。

采集部位 静脉采血抗凝剂 EDTA或肝素抗凝血要求 1.样本量1ml2. 样本应在采集后6小时内处理，冷冻或溶血的标本不能用3. 样本白细胞计数应在之间若＞X10#L， 样本需要稀释，用PBS稀释；若＜X10/L，应分离单个核细胞试剂口岫 品牌剂型规格贮存贝克曼库尔特成分1:单克隆抗体 液体(CD3/HLA-DR CD25-PC5CD3-FITC CD45RA-PECD45RO-PE CD4-PC5 )2：全血溶血试剂(Q-Prep)液体2—8°CA：甲酸液体70ML室温B：碳酸钠等液体32ML室温C：多聚甲醛（Optilyse C 液体3：鞘液 液体 20L液体14ML室温室温室温4：清洗液液体 5L 室温5：荧光微球液体 10ML 2-8^ （Flow-Check）仪器BeckmanCoulter EPICS XL/FC500/Altra样本制备：1） 按照要求，分别向已编好号的试管中加入10/20 ul单克隆抗体和同型对照2） 分别向试管中加入混匀的100u1抗凝血3） 混匀，避光，室温孵育20-30分钟4） 溶血：a. OptiLyse C（按说明书步骤溶血）b.使用COULTER Q—PREP制备系统开机---显示READY灯亮---选择35SEC灯亮---开门---放入试管 关门 自动进行溶血 显示READY灯亮 开门 取出试管 ---再进行下一个样品测定。

溶血前确认A/B/C管路充满并能打出液体）5） 上机测样（可根据样本情况选择洗或不洗上样）报告结果报告百分数操作性能精密度 批内五次重复CV<2 %参考值（百分数）CD3+/HLA-DR+ ±% CD3+/CD25+ ±%CD3+/CD45RO+ ±% CD3+/CD45RA+/CD4+ ±%临床意义、CD25、CD69是T细胞活化各个时期表达的标志性抗原，对其进行检测可以判断出疾病 的进程，有助于临床疾病的辅助诊断、预后和治疗如活化状态的监测是对机体移植 免疫状况判断的最主要依据，有助于临床选择治疗方案，CD25+/CD3+ >5-10%提示排斥、 持续增加提示应作病理活检；CD3+/HLA-DR+增加5-10%但不伴CD25增加提示MCV感染2.正常机体内各种T细胞之间以及与其他免疫细胞之间在数量上保持一定比例，如果它 们之间比例失调就会引起免疫功能紊乱，将导致机体免疫力下降和感染性疾病、自身 免疫病、肿瘤等疾病的发生，检测淋巴细胞各种亚群有助于疾病的诊断、预后和治疗 CD45RA、CD45RO均为T细胞的辅助分子，CD45RA+纯真型T细胞当免疫力下降时减少； CD45RO+记忆型T细胞对第二次抗原刺激极其敏感，通常在急性感染疾病中增加，在慢 性感染疾病中减少。

HLA-B27测定方法流式细胞仪（BeckmanCoulter,贝克曼库尔特）原理：双色直接免疫荧光法将HLA-B27-FITC/ HLA-B7-PE单克隆抗体加入到全血中， 与白细胞膜上相应的抗体结合，经过溶血、洗涤（和固定）等步骤后，在流式 细胞仪上进行分析，测定HLA-B7阴性而HLA-B27阳性细胞的平均荧光强度和 所占的百分比标本采集与处理受检者的准备 检查对象生活饮食处于日常状态采集部位 静脉采血抗凝剂 EDTA或肝素抗凝血要求 1.样本量1ml2. 样本应在采集后6小时内处理，冷冻的标本不能用3. 样本白细胞计数应在之间若〉X109/L， 样本需要稀释，用PBS稀释；若＜X109/L，应分离单个核 细胞 4.溶血样本不能用试剂品牌 剂型 规格 贮存贝克曼库尔特成分1：单克隆抗体 液体 1ML 2—8°C（HLA-B27/HLA-B7 同型对照 IgG1 / IgG2a ）2：全血溶血试剂液体A：甲酸液体70ML室温B：碳酸钠等液体32ML室温C：多聚甲醛液体14ML室温3：鞘液液体20L室温4：清洗液液体5L室温5：荧光微球液体10ML2-8 C质控品BEKAMANCOULTER产品，未开瓶的试剂于2-8C保存，可在有效期内保 持稳定，稀释的试剂于2-8C可稳定2周；每天校准一次：遇特殊情 况随时进行校准。

仪器BeckmanCoulter EPICS XL/FC500/Altra样本制备：1） 按照要求，分别向已编好号的试管中加入20 ul单克隆抗体和同型对照 （IgG2a-FITC / IgG1-PE）2） 分别向试管中加入混匀的100u1抗凝血3） 混匀，避光，室温孵育20-30分钟4） 溶血：a. OptiLyse C（按说明书步骤溶血）b.使用COULTER Q—PREP制备系统开机---显示READY灯亮---选择35SEC灯亮---开门---放入试管 关门 自动进行溶血 显示READY灯亮 开门 取出试管 ---再进行下一个样品测定溶血前确认A/B/C管路充满并能打出液体）5） 洗、离心、上机测样（备注：测B27 一定要至少洗一遍方可上机检测）报告结果报告阴阳性操作性能精密度 批内五次重复CV<2 %参考值阳性：HLA-B27阳性而HLA-B7阴性细胞的平均荧光强度在以上，阳性 率>90%临床意义HLA复合体位于第6号染色体的短臂上，该区DNA片段长度约3000-4000K。