内毒素的测定资料讲解.ppt

内毒素和1，3-D-葡聚糖检测的临床应用主要内容p内毒素的来源及结构p内毒素的生物学活性p内毒素检测的临床应用p内毒素的检测方法及参考范围p检测样本的采集及影响因素内毒素概述 内毒素是革兰氏阴性细菌细胞壁结构中的脂多糖（LPS），这些成分只在细菌死亡裂解后才释放到菌体外或活菌以发泡形式将其释出外层菌体多糖（O抗原），与细菌侵袭力有关中层同一种属之间是相同的内层特殊的糖磷脂，起毒性作用，而无种属特异性特异性多糖核心多糖类脂A内毒素的结构发热反应1激活血管活性物质的释放2激活凝血和纤溶系统3内毒素的生物学活性直接或间接损害肝脏5激活白三烯、前列腺素及单核巨噬系统6内毒素的生物学活性激活补体4内毒素的有益作用增加机体非特异性免疫力1防御放射性损伤，促进粒细胞生成2增加网状内皮系统功能3抗肿瘤，免疫佐剂作用4内源性内毒素血症外源性内毒素血症产生原因肠道内毒素的吸收1败血症时血中细菌的释放23有效的抗菌治疗后，细菌崩解输入了含有细菌的药物、血液或者体液等内毒素血症临床症状主要决定于宿主对内毒素的抵抗力症状和体征有：发热，白细胞数变化，出血倾向，心力衰竭、肾功能减退、肝脏损伤、神经系统症状，以及休克、血压下降、组织灌流不足、缺氧及酸中毒等。

内毒素血症的临床症状最严重的后果：致死性感染性休克，多器官功能衰竭，DIC等病死率极高肺炎100%、尿路感染70-80%、腹腔感染72-84%、烧伤85%、急性胰腺炎90%、败血症70%、急性肝炎37-64%、暴发性肝炎58-100%、丙肝61.54%、胆石症伴急性梗阻性化脓性感染85%、多器官功能衰竭100%各类疾病内毒素血症的发生率内毒素检测的临床应用在肝胆疾病中的应用1在呼吸系统感染中的应用2在胰腺疾病中的应用3在溃疡性结肠炎中的应用4在全身性细菌感染中的应用5在不明原因发热中的应用6内毒素检测在医院中的应用在医院灭菌制剂检验中应用1对注射器、输液器等医疗器械的内毒素检测2在透析站和血站中的应用3在临床医学研究中的应用4鲎试验是鲎试验是19681968年由年由LevinLevin和和BangBang建立其原理是利用鲎的变形细胞与微量内毒其原理是利用鲎的变形细胞与微量内毒素产生凝集反应的现象，作为判断试品素产生凝集反应的现象，作为判断试品中细菌内毒素含量的一种方法中细菌内毒素含量的一种方法内毒素的检测方法背面观 就像是古代武士的心甲腹面观腹部基本呈六角形，还可以看到它发达的附肢 内毒素的检测原理p革兰阴性菌脂多糖（内毒素）检测原理：革兰阴性菌脂多糖（内毒素）激活酶反应主剂中的相应因子后形成凝固蛋白， 根据其引起的浊度变化对革兰氏阴性菌脂多糖（内毒素）浓度进行定量测定。

内毒素的检测原理GG内毒素的检测方法 鲎试剂（Limulus amebocyte lysate LAL) 凝胶法0.03EU/ml范围内半定量1浊度法0.006-300EU/ml,检测范围大2比色法0.006-15EU/ml范围内定量3ELISA0.1pg/ml4流式细胞术测内毒素的量而不是活性5化学发光测定法6内毒素检测的参考值p检测值 10pg/ml,阴性p检测值介于1020pg/ml之间，临床观察期，建议动态采血检测p检测值 20pg/ml，阳性，建议再次采血以确诊 肝炎 败血症 肿瘤 内毒素浓度 50-320 20-1000 20-700 检测样本的采集及影响因素检测样本：血液采集要求：采样过程要求无菌操作，用专用的无热原真空采血管常规病人早上用药治疗前空腹采血/取样（血透患者透析前采血）样本保存：样本采集后应在3000转/分进行离心，若不能及时检测，应将血浆转移至无热原转移管内，在-30冰箱中冷冻保存，一周内使用特殊标本处理 ：对一般黄疸、溶血、乳糜血标本，稀释25倍后进行检测 ；对于严重的黄疸、溶血、乳糜血标本，应重新采血 影响结果的因素p产生假阳性的原因有：操作环境及操作过程中污染，应用某些抗生素类如-酰胺内酯类、喹喏酮类等患者。

MB-80微生物快速动态检测系统 (1-3)-D-葡聚糖侵袭性真菌感染的定义侵袭性真菌感染的定义定义定义: : 指致病性真菌侵犯皮指致病性真菌侵犯皮 下组织、黏膜、肌肉和下组织、黏膜、肌肉和内脏器官等所引起的真内脏器官等所引起的真菌感染性疾病，危害性菌感染性疾病，危害性较大条件致病性真菌条件致病性真菌念珠菌属念珠菌属曲霉属曲霉属其他其他侵袭性真菌感染的特点侵袭性真菌感染的特点1.1.不产生内毒不产生内毒 素和外毒素素和外毒素 致病机理不明致病机理不明4.4.早期症状无特异性，早期症状无特异性，往往被原发病掩盖，病往往被原发病掩盖，病程长，发现较晚，死亡程长，发现较晚，死亡率高率高2.2.致病力一般致病力一般 较弱，机体免较弱，机体免 疫低下时发生疫低下时发生3.3.感染菌种变化，感染菌种变化， 白色念珠菌感染下白色念珠菌感染下降，曲霉菌感染增降，曲霉菌感染增长趋势上升明显长趋势上升明显侵袭性真菌感染（侵袭性真菌感染（IFIIFI）现状）现状p IFIIFI发生率不断增加；发生率不断增加；pp IFIIFI感染病死率很高；感染病死率很高；pp IFIIFI诊断困难及漏诊情况严重诊断困难及漏诊情况严重。

1.内源性诱因2.外源性诱因影响机体抵抗力的各种疾病，如白血病、癌症、结核、肺脓肿、糖尿病、肝脏疾病以及维生素缺乏等l l 广谱抗生素，抗肿瘤药物和免疫抑制剂；广谱抗生素，抗肿瘤药物和免疫抑制剂；l l 插管等侵袭性治疗，骨髓和实体器官移植；插管等侵袭性治疗，骨髓和实体器官移植；l l 免疫缺陷综合症免疫缺陷综合症侵袭性真菌感染的诱因侵袭性真菌感染的诱因国内侵袭性真菌感染不容忽视国内侵袭性真菌感染不容忽视刘正印等，中华医学杂志2003,83(5):399-402感染人数感染人数国内侵袭性真菌感染不容忽视国内侵袭性真菌感染不容忽视临床药物治疗杂志 2007年第5卷第1期 感染率感染率(%)(%)中国感染与化疗杂志2008 年7 月20 日第 8 卷第4 期l 尸检研究发现，75%的侵袭性真菌感染病例在生前漏诊l 诊断困难的主要原因： - 临床表现不典型，易被基础疾病所掩盖-确诊常需侵入性手段获得组织标本，侵入性操作常因患者的病情所限难以实施-真菌检测项目开展相对不足或滞后IFI诊断困难及漏诊情况严重主要可引发侵袭性真菌感染的疾病主要可引发侵袭性真菌感染的疾病肺炎肺纤维症脑出血脑梗塞硬膜下血瘤术后胸部大动脉瘤术后糖尿病再生障碍性贫血MODSDIC胃癌，肝癌，肝内胆管癌，肺癌，多发性骨髓瘤，白血病，恶性淋巴瘤肺结核腹腔内脓肿AIDS呼吸系统呼吸系统疾病疾病感染及感染及寄生虫病寄生虫病循环系统循环系统疾病疾病内分泌内分泌疾病疾病血液及造血血液及造血器官疾病器官疾病肿瘤类肿瘤类侵袭性真菌感染(invasivefungalinfection,IFI)的发病率逐年上升,其中又以侵袭性肺部真菌感染(invasivepulmonaryfungalinfection,IPFI)最常见,大约占50%60%。

未经及时治疗的肺部真菌感染患者的病死率可高达30%80%侵袭性肺部真菌感染l临床表现：缺乏特异性,多表现为发热、咳嗽、咳痰、咯血、胸闷、呼吸困难等l 现 状：两高两低一快检测方法相对滞后,早期诊断和治疗仍存在困难,副作用小的 新型抗真菌药物价格昂贵,导致病死率高高院内感染率和病死率低临床和实验室诊断率 患者病情恶化快侵袭性肺部真菌感染死亡率死亡率(%)(%)诊断延迟诊断延迟时间时间 (h)(h)ICUICU诊断延迟时间与死亡率的关系诊断延迟时间与死亡率的关系111133333030353510101515202025253030353512 h12 h12-24 h12-24 h 24-48 h24-48 h48 h48 hMorrell M et al. Antimicrob Agents Chemother 2005, 49:36403645.美国四大医疗中心做的一项回顾性研究美国四大医疗中心做的一项回顾性研究死亡率死亡率(%)(%)诊断延迟时间诊断延迟时间(d)(d)Garey KW et al. Clin Infect Dis 2006, 43:2531 .1,6葡聚糖 磷脂双分子层几丁质麦角固醇1,3葡聚糖合成酶mannoproteins1,3真菌细胞膜、壁结构羊毛固醇C14去甲基化酶14位还原和78位异构酶角鲨烯环氧化酶1-3-D-1-3-D-葡聚糖本质及特点葡聚糖本质及特点真菌细胞壁成分，占50%以上1其他微生物、动物及人的细胞不含该成分2用于侵袭性真菌感染的早期诊断3(1-3)-D-(1-3)-D-葡聚糖特性葡聚糖特性1.2.3.对热极为稳定，高压对热极为稳定，高压121121并不能使其灭活。

并不能使其灭活在念珠菌和曲霉菌细胞在念珠菌和曲霉菌细胞壁中含量较多，对壁中含量较多，对GG试验灵敏试验灵敏当真菌进入人体血当真菌进入人体血液或深部组织后，液或深部组织后，经吞噬细胞的吞噬经吞噬细胞的吞噬、消化等处理后，、消化等处理后，(1-3)-D-(1-3)-D-葡聚糖可葡聚糖可从胞壁中释放出来从胞壁中释放出来，从而使血液及其，从而使血液及其它体液中含量增高它体液中含量增高当真菌在体内含当真菌在体内含量减少时，机体免量减少时，机体免疫系统可将其清除疫系统可将其清除在浅部真菌感染在浅部真菌感染中，中，(1-3)-D-(1-3)-D-葡聚糖未被释放葡聚糖未被释放出来，故其在体出来，故其在体液中的量不增高液中的量不增高G”试验缘何而来？pp1-3-D1-3-D- -葡聚糖可特异性激活鲎变形细胞裂解葡聚糖可特异性激活鲎变形细胞裂解物中的物中的GG因子，引起裂解物凝固，故称因子，引起裂解物凝固，故称GG试验1-31-3） -D-Glucan-D-GlucanLAL-RM(LAL-RM(反应物反应物) )GG因子因子活化活化GG因子因子凝固酶原凝固酶原凝固酶凝固酶凝固蛋白原凝固蛋白原凝固蛋白（凝胶）凝固蛋白（凝胶）试验反应机理图：试验反应机理图：内毒素与-葡聚糖的检测比较已知能与鲎试剂发生反应的物质有细菌内毒素和-葡聚糖，但它们的反应曲线不一样。

内毒素反应曲线为S型特征曲线，而-葡聚糖反应曲线为经过0点的斜线 内毒素和-葡聚糖与鲎试剂反应的特征曲线观察期不确定，费时费力，特征性不明显并对医师的专业水平要求高辅助方法：临床表现，免疫学，病理学，影像学检查等用于实验室检测，已成为这一领域研究的热点3.PCR技术：真菌的抗原、抗体及代谢产物的血清学检查和真菌核酸检测对儿童及接受造血干细胞移植患者、ICU患者不适用 2.GM试验：曲霉属半乳甘露聚糖抗原检测判断是否曲霉属真菌感染耗时短，灵敏度高，特异性强，定量检测可判断感染严重程度1.G试验：通过检测(1-3)-D-葡聚糖的含量，判断是否有真菌感染非传统检查敏感性低，耗时长, 培养阳性率低培养结果是定性的，有些标本采集困难直接培养真菌法传 统检 查特特 点点方方 法法侵袭性真菌感染的临床检测方法对比侵袭性真菌感染的临床检测方法对比科玛嘉念珠菌显色培养基的菌落颜色： p热带念珠菌-灰蓝色p白色念珠菌 -绿色p克柔念珠菌-粉红色p光滑念珠菌-紫红色p其他念珠菌-白色科玛嘉念珠菌显色培养基的菌落颜色： A/E-白色假丝酵母菌，B/C-克柔假丝酵母菌，F-光滑假丝酵母菌，D-热带假丝酵母菌-D-葡聚糖的评价l l可检测多种致病真菌感染可检测多种致病真菌感染 念珠菌，曲霉，肺孢子菌，镰刀菌，地霉，组织胞浆菌，念珠菌，曲霉，肺孢子菌，镰刀菌，地霉，组织胞浆菌， 毛孢子菌等毛孢子菌等l l不能检测隐球菌、接合菌（根霉、毛霉、根毛霉、犁头霉等）不能检测隐球菌、接合菌（根霉、毛霉、根毛霉、犁头霉等）l敏感性、特异性：90左右 对于念珠菌血症对于念珠菌血症, G, G试验检测是首选检查试验检测是首选检查J. Clin. Microbiol. 2008.46:10091013. BG值在IFI临床表现出。