棉花异质型ACCase基因家族鉴定与功能分析.docx

棉花异质型ACCaseS因家族鉴定与功能分析棉花是重要的经济作物和油料作物棉籽中含有丰富的脂肪酸,可用于加工食用油、工业原料和生物柴油异质型ACCase（heterromericAcetyl-CoAcarboxylase,ACCase）是各种脂肪酸从头合成的限速酶和关键酶,它由生物素羧化酶（BC）、生物素羧基载体蛋白（BCCP及竣基*$移酶（CT）的2个亚基a-CT和B-CT组成本研究是在棉属（Gossypium）二倍体种（雷蒙德氏棉、亚洲棉）和四倍体种（陆地棉、海岛棉）基因组测序完成的基础上，对棉花异质型ACCase勺三个核基因组编码的亚基基因家族进行全基因组水平鉴定和比较;在低温和盐胁迫处理下,雷蒙德氏棉、亚洲棉（石系亚1号）和陆地棉（TM-1）中所CCP®因响应的方式存在差异；结合公共数据中陆地棉（G.hirsutum）TM-l胁迫条件下的RNA-Se徵据，探究BCCPBCffiCTa基因家族成员在不同非生物胁迫下的应答反应对GhBCCPl白亚细胞预测结果进行验证，并克隆其上游1.5kb的启动子序列,进行缺失系列载体构建和活性研究对Xu244（转基因受体材料）中异质型ACCas叫亚基基因在各组织和不同非生物胁迫中的表达模式进行分析。

对异质型GhACCas迪亚基中过表达单基因转化材料进行筛选、油分测定，两两聚合取得的主要研究结果如下:1.从雷蒙德氏棉、亚洲棉、陆地棉和海岛棉全基因组数据中分别鉴定出24个BCCPS因（4个GaBCCP4个GrBCCP8个GhBCC和8个GbBCCP）12个BC基因（2个GaBG2个GBBC4个GhBC和4个GbBC刖11个CTa基因（3个GaCTa、2个GrCTa、4个GhCTc和2个GbC%）,均以单个基因的形式分布在染色体上亚洲棉中CTa基因比雷蒙德氏棉中多1个，陆地棉CTa基因比海岛棉中多2个对四个棉种中BCCPS因成员进行系统进化分析，结果表明BCC现因家族可分为2个组；组I中基因长度比组R中的变化大，两个组的基因结构比较复杂；基因复制结果表明，片段复制是导致陆地棉和海岛棉中BCC现因数目扩增的主要原因四个棉种间分别成功鉴定出20组、6组和6组BCCPBC和CTa直系同源基因，其中分别有11组、3组和3组BCCPBC和CTa直系同源基因结构非常相似,剩余9组BCCP3组BC和3组CTa直系同源基因结构存在差异，推测大多数直系同源基因的基因结构保守性一般2.雷蒙德氏棉、亚洲棉(石系亚1号)和陆地棉(TM-1)中16个BCC现因在盐胁迫24h后,6个BCCFS因在根中表达上调,在茎中，雷蒙德氏棉和亚洲棉中的BCC现因盐胁迫24h后表达上调；低温胁迫下,GrBCCP3GaBCCRIGaBCCR2GaBCCR3GaBCCP4口GhBCCP祢根中诱导上调表达。

GrBCCP3GaBCCP1GaBCCP3GaBCCP低温胁迫24h后，在茎中上调表达;同时发现在盐和低温胁迫24h后,GrBCCP3GaBCCR1GaBCCP2GaBCCP4茎中均表达上调，GaBCCP1ffiGaBCCP3叶片中均诱导表达基于TM-1不同组织和不同非生物胁迫的RNA-Se吸据，对陆地棉中8个BCCP4个BC和4个CTa基因进行转录本分析，结果表明它们在检测的组织中均有表达，其中4个BCCPS因(GhBCCP2GhBCCR4GhBCCP6GhBCCP7)2个BC基因(GhBC和GhB3)和2个CTa基因(GhCTa1和GhCTa3)在不同发育时期的幼胚中转录水平较高，这些基因可能对脂肪酸积累起到积极作用；在不同非生物胁迫下，GhBCCP傕盐胁迫、干旱胁迫处理下呈现升-降-升趋势，表明GhBCCP基因在这两种胁迫中可能受到反馈调节作用；在盐胁迫、干旱和热胁迫处理下，GhBCCP方口GhBCCP6调表达，可能起负调控作用；热胁迫处理下陆地棉中4个GhBCt调表达,说明这4个GhBC基因在热胁迫下起正向调控作用;热胁迫、干旱和盐胁迫处理12h后,陆地棉中GhC%1、GhC%3和GhCTc4基因上调表达,可能这三个基因在这三种胁迫下起正向调控作用。

这些结果表明GhBCCPGhBG口GhCTc基因成员确实参与不同非生物胁迫的应答反应3.GhBCCP假白定位在叶绿体上，GhBCCP1©动子系列缺失片段研究发现,在1449-1195bp之间存在比较重要的DOF核心元件和1个MY肌件，它们对启动子活性有很大的影响4 .异质型GhACCse四个亚基基因在Xu244材料的根、茎、叶和纤维不同发育时期的组织中均有表达，但表达水平不同，其中GhCF在叶片中的表达量最高推测可能是叶片中叶绿体含量比较丰富在ABA处理12h后,GhBCCP1GhBC1GhC%2和GhCF均上调表达，推测在ABAM理12h后这四个基因可能协同响应ABAM理，而在低温和MeJAfe理下表达模式并不一致，暗示异质型ACCas叫个亚基在低温和MeJA处理下有不同的应答机制5 .八份材料的棉仁油分含量测定结果表明,棉仁在20-30DPA阶段油分积累速度最快,30-35DPA阶段油分积累速度变慢,35-40DPA阶段有4份材料棉仁油分含量开始下降；8份棉花材料幼胚白不同发育时期，异质型GhACCas幽个亚基基因表达结果显示,棉仁油分含量较高的材料,四个基因表达高峰集中在幼胚发育的同一时期，如10H1041的油分含量为35.29%,四个亚基表达高峰均在幼胚发育的25DPA;棉仁油分含量相对高的材料，三个基因表达高峰出现在幼胚发育的同一时期，如11-0514和10H1007的油分含量分别为29.51%?口29.69%,GhBCCP1GhBC评口GhCTc2表达高峰均在幼胚发育的35DPA,10H1014材料的油分含量为33.55%,GhBCCPIGhBCMGhCTc2表达高峰在幼胚发育的25DPA棉籽油分含量低的材料,两个基因表达高峰在同一个时期（GhBCCP和GhhC1GhC%2和GhCTB表达高峰分别在幼胚发育的不同时期）或四个亚基表达高峰均不在一个时期，如Xu244、11-0711、11-0509和11-0512。

这些结果表明棉籽油分含量高的棉花材料，异质型ACCas叫个亚基基因在种子油分积累白^主要时期倾向于协同表达,而在棉籽油分含量低的材料中,其在油分积累的主要时期协同表达趋势较弱6.过表达异质型GhACCase勺单个亚基材料中万3代GhBCCP转基因株系油分含量增加21.92%,达到显著水平；GhBC1转基因株系和GhCR转基因株系的油分含量均约增加17%达到显著水平；GhCTa2转基因株系的油分含量较受体材料未达显著水平说明过表达GhBCCR1GhBC便口GhCR基因均能提高棉籽油分，而GhCT.2基因提高油分的功能有待进一步研究转GhCF基因的T5代棉仁平均含油量较对照提高4.27百分点，过表达GhBCCP1口GhBC的T5代转基因材料棉仁平均油分含量较对照分别提高1.01和1.67个百分点，GhCTa2的T5代转基因材料比对照平均降低0.51个百分点，本研究中T6和T9代四个亚基转基因材料油分结果与T5代的结果基本一致这些结果表明分别过表达GhCR、GhBC评口GhBCCP1亚基对提高棉仁油分具有一定的潜能GhBCCP1GhCF的两个聚合株系成熟期棉仁油分含量与亲本无显著区别，而GhCRxGhBC体口GhBCCP1GhCTi2聚合材料成熟期的棉仁油分含量显著低于亲本材料。

这些结果表明目前两两聚合的亚基转基因材料没有显著提高油分含量，其原因可能是两聚合的转基因植株体内没有提高ACCas由勺活性，将四个亚基全部聚合在一起进行过表达或许可以提高棉籽油分含量,但这推论还需进一步的研究。