高效液相常见问题与解决

1、 高效液相色谱仪使用中常见问题及解决方法l 高效液相色谱仪系统 液相色谱仪主要由贮液瓶、泵、进样器、柱子、柱温箱、检测器、数据处理系统组成。对于整个系统而言，柱子、泵和检测器是核心部件同时也是易出问题的主要部位。l 常见问题及解决方法 高效液相作为一种高精密仪器，如果在使用过程中不按照正确操作的话，就容易导致一些问题。其中最常见的就是柱压问题、漂移问题、峰型异常问题。1 柱压问题 柱压问题是使用高效液相色谱过程中需要密切注意的地方，柱压的稳定与色谱图峰形的好坏、柱效、分离效果及保留时间等密切相关。所谓柱压稳定并不是指压力值稳定于一个恒定值而是指压力波动范围在345kPa 以内或在50PSI（针对Waters高效液相色谱仪）之间（在使用梯度洗脱时，柱压平稳缓慢的变化是允许的）。压力过高、过低都属于柱压问题。1.1 压力过高 这是高效液相在使用中最常见的问题，指的是压力突然升高，1、 一般都是由于流路中有堵塞的原因。此时，我们应该分段进行检查。(1).首先断开真空泵的入口处，此时PEEK管里充满液体，使PEEK管低于溶剂瓶，看液体是否自由滴下，如果液体不滴或缓慢滴下，则是溶剂过滤头堵塞。处

2、理方法：用30%的硝酸浸泡半个小时，在用超纯水冲洗干净。如果液体自由滴下，溶剂过滤头正常，在检查；(2).打开Purge阀，使流动相不经过柱子，如果压力没有明显下降，则是过滤白头堵塞。处理方法：将过滤白头取出，用10%的异丙醇超声半个小时。如果压力降至100PSI以下，过滤白头正常，在检查；(3).把色谱柱出口端取下，如果压力不下降，则是柱子堵塞。处理方法：如果是缓冲盐堵塞，则用95%的水冲至压力正常。如果是一些强保留的物质导致堵塞，则要用比现在流动相更强的流动相冲至压力正常。假如按上面的方法长时间冲洗压力都不下降，则可考虑将柱子的进出口反过来接在仪器上，用流动相冲洗柱子。这时，如果柱压仍不下降，只有换柱子入口筛板，但一旦操作不甚，很容易造成柱效下降，所以尽量少用。问题无法解决可考虑更换色谱柱。2、 流速设定不正确：可重新设定正确流量。3、 流动相配比不正确：不同配比的流动相其黏度系数不相同，较高黏度的流动相相应的系统压力也大，如果可能可更换黏度较小的溶剂或重新设定配比。4、 系统压力零点漂移：调节压力传感器的零点。5、 阻尼器堵塞：拆下后进行超声波清洗或更换新的阻尼器。6、 进样器堵

3、塞：参见说明书清洗。7、 管路或连接口堵塞：更换被堵塞管路或按说明书进行清洗。8、 柱端过滤器堵塞：拆下过滤器用硝酸超生清洗9、 长期使用柱端固定相板结：挖掉板结部分修补柱端10、分析生化、染料等易污染固定相的样品：方法同上, 采用保护柱1.2 压力过低 1、 一般是由于系统泄漏，处理方法：寻找各个接口处，特别是色谱柱两端的接口，把泄漏的地方旋紧即可。拆下柱子加适当力拧紧或衬四氟薄膜。2、泵里进了空气，但此时表现的往往是压力不稳，忽高忽低，更严重一点会导致泵无法吸上液体。处理方法：打开Purge阀，用35ml/min的流速冲洗，如果不行，则要用专用针筒在排空阀处借住外力将气泡吸出。3、无流动相流出：检查储液瓶中有无流动相，沉子是否浸在流动相中，泵是否运行。4、参比阀未关闭：将流速降低后关闭参比阀。一般降至0.10.2mL/min后关闭参比阀。1.3其它压力问题1、 压力传感器故障，柱压升高或降低或无柱压:与供应商联系进行维修。2、 系统管路中存在气泡，柱压不稳：重新进行排气操作。( 可重复多次，直至气泡排出)3、 沉子表面的小孔被堵塞，柱压在较大范围内波动：将沉子取下后进行超声波清洗。

4、2 基线问题 2.1基线漂移 基线漂移是色谱工作者普遍遇到的问题,在实际工作中,我们经常能遇到基线漂移的情况,特别是在梯度洗脱的时候,基线漂移是常有的事。一般说来，机器刚起动时，基线容易漂移，大概要30min的平衡时间，如果你用了缓冲溶液或缓冲盐，还有就是在低波长下（220nm）平衡时间相对会比较长，但如果你在实验过程中发现基线漂移，则你要考虑下面的原因：1、 柱温波动 控制好柱子和流动相的温度，检查是否有打开的窗户或空调对着柱温箱。(即使是很小的温度变化都会引起基线的波动。通常影响示差检测器、电导检测器、较低灵敏度的紫外检测器或其它光电类检测器。)控制好柱子和流动相的温度,在检测器之前使用热交换器。2、流通池被污染或有气体 用甲醇或其他强极性溶剂冲洗流通池（最好断开柱子）。如有需要，可以用1N的硝酸（不要用盐酸）。3、紫外灯能量不足 更换新的紫外灯4、流动相污染、变质或由低品质溶剂配成。 检查流动相的组成，使用高品质的化学试剂及HPLC级的溶剂。5、样品中有强保留的物质（高K值）以馒头峰样被洗脱出，从而表现出一个逐步升高的基线。 使用保护柱，如有必要，在进样之间。在分析过程中，定期用

5、强溶剂冲洗柱子。6、检测器没有设定在最大吸收波长处 将波长调整至最大吸收波长处7、流动相的PH值没有调节好 加适量的酸或碱调至最佳PH值8、 流动相不均匀: (流动相条件变化引起的基线漂移大于温度导致的漂移。)使用HPLC级的溶剂,高纯度的盐和添加剂,流动相在使用前进行脱气,使用中使用氦气。9、 检测器出口阻塞: (高压造成流通池窗口破裂,产生噪音基线)取出阻塞物或更换管子。参考检测器手册更换流通池窗。10、 流动相配比不当或流速变化:更改配比或流速。为避免这个问题可定期检查流动相组成及流速。11、 柱平衡慢特别是流动相发生变化:用中等强度的溶剂进行冲洗,更改流动相时,在分析前用1020倍体积的新流动相对柱子进行冲洗。12、 使用循环溶剂,但检测器未调整:重新设定基线。当检测器动力学范围发生变化时,使用新的流动相。2.2基线噪音 对于紫外检测器, 氘灯光源打开后要预热30 min以上, 基线才能稳定。噪声是指与被测物无关的检测器输出信号的随机扰动变化, 分短期噪声和长期噪声两种。 氘灯用的过久, 接近寿命期时( 氘灯的寿命约1 000 h) , 会使基线噪音明显增加, 应及时更换氘灯。

6、除光源外, 流路中的气泡也会产生噪音。对于判断基线噪声增大是由于光源灯的老化还是来自流路中的气泡的问题, 可将泵关上, 继续走基线, 如果噪声立即停止, 基线呈一条直线, 说明基线噪声来自流动相中的气泡, 应设法排气; 若停泵后仍有噪音出现, 应考虑是灯的问题。 电化学检测器中的工作电极( 安培型) 对气泡十分敏感, 仪器的平衡时间较长。流路中如果有气泡存在, 不仅基线会出现尖峰, 还会影响检测。因此,做电化学检测时, 流动相的配制要很严格, 水要超纯、除还原物, 配好后一定要过滤脱气, 还应现用现配。如果泵系统不是PK 材料, 即电化学分析专用仪器, 而是普通的高效液相色谱不锈钢泵, 应对系统中的不锈钢材料的输液泵、进样器和管道, 在分析前用6 molL-1 硝酸溶液钝化( 注意断开分离柱) , 可缩短基线平衡时间。还可在流动相中加入EDTA 离子隐蔽剂, 也是可以的。如果有较大的气泡进到检测器中, 光靠泵冲可能太慢, 可暂时将泵停止, 关上电化学检测器, 拆下工作电极, 用超纯水冲洗电极表面, 也很奏效的, 但对液相色谱技术不太熟练的技术员要小心操作, 不宜反复这样拆卸。2.2.1

7、基线噪音(规则的) 产生基线噪音的原因有：在流动相、检测器或泵中有空气；漏液；流动相混合不完全；温度影响(柱温过高,检测器未加热)；在同一条线上有其他电子设备；泵振动。 了避免基线噪音,在正式进样之前,需要对流动相脱气；冲洗系统以除去检测器或泵中的空气；检查管路接头是否松动；泵是否漏液；是否有盐析出和不正常的噪音,如有必要,更换泵密封；用手摇动使溶剂混合均匀或使用低粘度的溶剂减少差异或加上热交换器；有其他电子设备时断开LC、检测器和记录仪,检查干扰是否来自于外部,加以更正；泵振动时在系统中加入脉冲阻尼器。2.2.2 基线噪音(不规则的)(1) 漏液：检查接头是否松动,泵是否漏液,是否有盐析出和不正常的噪音。如有必要,更换密封,检查流通池是否漏液。(2) 流动相污染、变质或由低质溶剂配成：检查流动相的组成。(3) 流动相各溶剂不相溶：选择互溶的流动相。(4) 检测器/记录仪电子元件的问题：断开检测器和记录仪的电源,检查并更正。(5) 系统内有气泡：用强极性溶液清洗系统；检测器内有气泡,清洗检测器,在检测器后面安装背景压力调节器。(6) 流通池污染(即使是极少的污染物也会产生噪音) :用硝

8、酸清洗流通池;(7) 检测器灯能量时不足更换灯;(8) 色谱柱填料流失或阻塞:更换色谱柱。(9) 流动相混合不均匀或混合器工作不正常:维修或更换混合器,在流动相不走梯度时,不建议使用泵的混合装置。3 保留时间3.1保留时间漂移 保留时间的漂移往往由柱老化引起,而柱老化不可能引起保留时间的无规律波动。事实上,保留时间漂移的多半原因是由于不同机理的色谱柱老化,如固定相流失(例如通过水解) ,色谱柱污染(由样品或流动相所致)等。保留时间漂移的几种最常见的原因和解决方法如下：(1) 色谱柱平衡 如果观察到保留时间漂移,首先应考虑色谱柱是否已经平衡。在每一次运行之前给予足够的时间平衡色谱柱。通常平衡需要1020个柱体积的流动相,但如果在流动相中加入少量添加剂(如离子对试剂)则需要相当长的时间来平衡色谱柱。流动相污染也可能是原因之一。溶于流动相中的少量污染物可能慢慢富集到色谱柱上,从而造成保留时间的漂移。应注意:水是很容易污染的流动相成分。(2) 固定相稳定性 固定相的稳定性都是有限的,即使在推荐的pH范围内使用,固定相也会慢慢水解。例如,硅胶基质在pH4时水解稳定性最好,水解速度与流动相类型和配

9、体有关。双官能团配体和三官能团配体比单官能团配体的键合相要稳定;长链键合相比短链键合相稳定;烷基键合相比氰基键合相稳定的多。经常清洗色谱柱亦会加速色谱柱固定相的水解。其他硅胶基质键合相在水溶液环境中也可以发生水解,如氨基键合相等。(3) 色谱柱污染 保留时间漂移的另一个常见原因是色谱柱污染。HPLC色谱柱是非常有效的吸附性过滤器,它可以过滤并吸附流动相携带的任何物质。污染源可以是:流动相本身,流动相容器,连接管、泵、进样器和仪器密封垫,以及样品等。通常通过实验可判断污染的来源。样品中如果存在色谱柱上保留很强的组分,就可能是使保留时间漂移的潜在根源。这些根源通常是样品基质,如:配药中的赋形剂,生化样品(如血清)中的蛋白及类脂类化合物,食品样品中的淀粉,环境水样中的腐殖酸等。通常样品中的强保留组分具有较高的分子量,在此情况下,保留时间漂移的同时或其后会有反压的增加,可以通过使用固相提取( SPE)等样品前处理方法来去除样品基质的影响,避免色谱柱污染最简单的方法是防患于未然。相比之下,找到问题的所在并设计有效的清洗步骤以去除污染物要困难的多。通常使用在给定色谱条件下的强溶剂,但并非所有污染物都可以在流动相中溶解。如THF可去除反相色谱柱中的许多污染物,但蛋白在THF中就不能溶解, DMSO常常用于去除反相色谱柱中的蛋白。使用保护柱是个非常有效的方法。反冲色谱柱仅是不得已时采用的办法。(4) 流动相组成 流动相组成的缓慢变化也是保留时间漂移的常见原因。如流动相中易挥发组分的挥发及循环使用流动相等,应防止流动相由于蒸发、反应等等原因造成的变化。(5) 疏水坍塌 当小孔径、端基封口良好的反相填料色谱柱使用接近100%的水为流动相时,有时会发生分离突然丧失及被分析物质保留明显降低或完全不保留

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