体外扩增高纯度的人外周血来源的NK细胞的研究

1、1体外扩增高纯度的人外周血来源的 NK 细胞的研究作者：李晓红马健汪菲菲窦立萍李猛高春记【摘要 】 本研究探讨从人外周血中分选及扩增高纯度 NK 细胞的优化技术。先用 miniMACS 及阴性免疫磁珠分选方法，从外周血单个核细胞（PBMNC）得到纯化的 NK 细胞，随后在干细胞培液基条件下，通过 IL2、IL12 和 IL15 等细胞因子的不同组合将培养体系分为 IL2 组、IL2+IL12 组、IL2+IL15 组、IL2+IL15+IL12组和对照组（不加任何细胞因子） ，分别培养 15 天，每 3 天半量换液并补充细胞因子；检测分选及扩增前后（CD3-CD56+）NK 细胞含量、扩增倍数及扩增前后各组在不同效靶比下的杀伤率。结果显示经：miniMACS 阴性免疫磁珠分选后（ CD3-CD56+）NK 细胞含量由分选前的 11.195.25%提高到 94.233.50%。培养 15 天后除对照组（CD3-CD56+）NK 细胞纯度略下降外，其余 4 组与扩增前无显著性差异（P0.05） 。在IL2、IL2+IL12、IL2+IL15 、IL2+IL15+IL12 培养体系中， NK

2、 细胞扩增倍数分别为 15.431.08，19.873.87，50.464.31 和52.356.72，均显著高于对照组 6.141.0（P0.01） ，但IL2+IL15 与 IL2+IL15+IL12 组间未见显著差异（ P0.05） 。各组扩增的 NK 细胞对 K562 细胞的杀伤率均较扩增前增强，在不同效2靶比下 IL2+IL15、IL2+IL15+ IL12 组对 K562 细胞的杀伤率显著高于其他组，但两组间无显著性差异（P0.05） 。结论：经miniMACS 免疫磁珠阴性分选得少量 NK 细胞后，应用 IL2+IL15培养条件是获得高纯度 NK 细胞的简单有效方法。 【关键词】 NK 细胞； miniMACS； 白介素 2； 白介素 12； 白介素 15Ex Vivo Expansion of Highly Purified NK Cells from Human Peripheral BloodAbstract Adoptive immunotherapy using allogeneic natural killer (NK) cells provides to b

3、e useful in recipients after allogeneic hematopoietic stem cell transplantation (AlloHSCT), but its application has been limited by the inability to obtain sufficient numbers of pure NK cells. This study was aimed to optimize the expansion of high purity NK cells from human peripheral blood. First, the NK cells were isolated from PBMNC by using miniMACS (magnetic cellselection) and NK Cell Isolation Kit . Then the isolated cells were cultured in SCEM (Stemline Hematopoietic Stem Cell Expansion M

4、edium, Sigma) supplemented with 10% 3human AB serum and different combinations of IL2 and/or IL12, IL15 for 15 days. Cultures were fed with fresh media and cytokines every 3 days, and were evaluated for cell expansion, phenotype, and cytotoxicity at the end of the culture period. The results showed that in group IL2+IL15 and IL2+IL15+IL12, cells were expanded 50.464.31 and 52.356.72fold respectively, much higher than others（P0.01), but no significant difference between themselves (P0.05). And th

5、e purity of CD3-CD56+ NK cells was over 94% in all groups except the control. The cytotoxicity of expanded NK cells cultured with cytokines was significantly higher than the starting population at different E:T ratio（P 0.01), although the cytotoxicity of IL2+IL15+IL12 group was slightly higher than that of IL2+IL15 group, but no significant difference between themselves (P 0.05). It is concluded that high purity of NK cells can be efficiently expanded in culture with IL2+IL15.Key words natural k

6、iller cell; miniMACS ; IL2, IL12, IL1NK 细胞作为机体固有免疫的重要组成部分是机体抗肿瘤、抗感染的第一道天然防线。随着对 NK 细胞生物功能及活化机制的了解，4NK 细胞在造血干细胞/骨髓移植的辅助治疗及肿瘤过继免疫治疗方面的作用倍受关注。最近在异基因造血干细胞移植中发现供者异源反应性 NK 细胞可以发挥移植物抗白血病(graftversusleukemia，GVL)效应，并减少移植物抗宿主病(graftversushost disease，GVHD)的发生1-3 ，故输注供者异源反应性 NK 细胞已经成为临床移植辅助治疗的新策略 4,5 。然而，外周血中 NK 细胞含量少（约占淋巴细胞的 5%-7%） ，且目前尚缺乏有效的体外扩增体系，所以 NK 细胞的广泛临床应用受到了限制。目前的许多体外研究均显示 IL2、IL12 、IL15 对促进NK 细胞的分化成熟、活化、增殖及细胞毒活性有重要作用。本研究从方法学角度探索提高 NK 细胞纯度并采用 IL2、IL12 、IL15等细胞因子的不同组合，以期优化 NK 细胞体外扩增的效率及纯度，为 NK 细胞

7、的进一步临床应用奠定基础。材料NK 细胞分选试剂盒（NK Cell Isolation Kit ，包括荧光标记抗体、磁珠）及 miniMACS 磁珠分选系统、分离柱（ MS Column）均购自德国美天意公司（Miltenyi Biotec,Germany） 。造血干细胞扩增培养基(Stemline Hematopoietic Stem Cell Expansion Medium，SCEM)为 Sigma 公司产品，RPMI 1640 培养液为 Gibco 公司产品。人 AB 血清购自杭州四季青生物制品公司。5IL2、IL12 、IL15 为 Cytolab 公司产品。左旋谷氨酰胺（Lglutamine ）为 Sigma 公司产品。流式细胞仪及荧光抗体FITCCD3、PECD56 、FITCIgG1 、PEIgG1 均为 Becton Dickinson 公司产品。CCK8 试剂盒（Cell Counting Kit8，新型细胞检测 MTT 法改良试剂）购自日本同仁化工。K562 细胞为我科实验室长期保存。外周血来源于我院健康献血者。外周血采集与单个核细胞分离健康献血者 10 名，采集

8、肘静脉外周血 20 ml，肝素抗凝，用PBS 等体积稀释后，用淋巴细胞分离液以密度梯度离心法分离得到单个核细胞（PBMNC） ，PBS 洗涤 1 次。NK 细胞分离纯化将上述 PBMNC 用溶红素处理，然后用 MACS buffer 洗涤 1 次，血细胞计数板计数。每 107 个细胞重悬于 40 l MACS buffer，加入 10l NK cell biotinantibody cocktail，4-8孵育 10 分钟，然后依次加入 30l MACS buffer、20l antibiotin micro beads，4-8 孵育 15 分钟，再次用 MACS buffer 洗涤标记好的细胞，重悬于 500l MACS buffer 中。选用 MS 分离柱，安放于miniMACS 分离器磁场中，使用前润湿分离柱，将分离柱放置于合6适的细胞收集管上。将细胞悬液上柱，用 3500l MACS buffer洗柱，收集细胞。纯化前后计数单个核细胞，并以 CD3、CD56 荧光标记抗体分析 NK 细胞数，计算细胞回收效率和纯化效率。细胞培养将分离纯化的 NK 细胞加入含有 10%人 AB 血

9、清、2 mmol/L 左旋谷氨酰胺、青、链霉素（各 100 U/ml）及细胞因子的 SCEM 培养体系内，调至细胞终浓度 2105/ml，然后接种于 24 孔板，每孔终体积为 1 ml；培养体系按细胞因子的不同组合分为 4 组： A 组：IL2（200 U/ml） ，B 组： IL2(200 U/ml)+IL12(10 ng/ml)，C 组：IL2(200 U/ml)+IL15(20 ng/ml)，D 组： IL2(200 U/ml)+IL15(20 ng/ml)+IL12(10 ng/ml)，E 组：不加任何细胞因子为对照组。每组复种 3 孔，置 37、5% CO2、饱和温度培养箱中培养，每 3 天半量换液并全量补充上述细胞因子。于培养第 0、5 、10 、15 天通过台盼蓝染色法计数并检测细胞活性。免疫表型分析将取自不同来源的细胞用荧光抗体 CD3FITC、CD56PE 标记，流式细胞仪检测及分析，了解 NK 细胞纯度。7白血病细胞系的培养K562 细胞种于含有 10%FCS 的 RPMI 1640 培养体系中，置37、5% CO2、饱和湿度培养箱中培养。NK 细胞杀伤活性检测收集对数生长期 K562 细胞及培养第 0、15 天 NK 细胞。以K562 细胞为靶细胞，调整细胞密度为 1105 /ml；NK 细胞为效应细胞，根据不同效靶比分别调整细胞密度为 1105 /ml、5105 /ml、1106 /ml。按不同效/靶比（11、51、101 ）将效应细胞与靶细胞混合，同时设相应的靶细胞孔，效应细胞孔和培养基空白对照孔。每组均设 3 个平行孔。置 37、5% CO2、饱和湿度培养箱中培养 12 小时后每孔加入 10 l CCK8（ Cell Counting Kit8：新型细胞检测 MTT 法改良试剂） ，混匀，于 37、5% CO2 培养箱中继续培养 4 小时后用酶标仪测定每孔 450 nm 波长处的 OD 值。细胞毒活性的计算方法：求出 3 个平行孔的平均值，按以下方法计算 NK 细胞毒活性，以

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