人胎盘组织造血干-祖细胞的分离富集

1、1人胎盘组织造血干/ 祖细胞的分离富集作者：章涛，陈代雄，方宁，刘祖林，祁莹，刘金伟【摘要 】 为了探索从胎盘组织中分离富集造血干/祖细胞（HSPC）的标化流程，采用机械法加胶原酶消化法制备人胎盘组织单个细胞悬液，用羟乙基淀粉（6% HES）法从中分离出单个核细胞（MNC） ，再经免疫磁珠分选法分选出 CD34-、CD34+CD38-、CD34+CD38+ 3 个细胞亚群，用流式细胞术对各阶段分选细胞进行表型分析并计算分选细胞的富集度和回收率。结果表明：机械法加胶原酶消化法制备的人胎盘组织单个细胞悬液中单个核细胞（MNC）数达（ 12.303.51）108，与脐血初始样品所含的MNC 数（ 8.865.38）108 比较差异无统计学意义，而其CD34细胞所占百分率（3.932.31 ）%则明显高于脐血（0.440.29） 。胎盘组织单个细胞悬液经 6% HES 分离后MNC 和 CD34细胞的回收率分别为（45.311.7）和（51.19.8 ）% ；MNC 经免疫磁珠分选后，其 CD34细胞的纯度和回收率分别为（73.414.1）和（52.711.7）%。结论：本实验所建立的”机械法

2、加胶原酶消化法-HES 分离 MNC-MACS 分选目标细胞”的分离纯化方法可从胎盘组织获得高丰度、高富集度、高活性的 HSPC，为进一步研究胎盘 HSPC 提供了比较经济、效果2较好的分离富集方案。 【关键词】 CD34 抗原；造血干细胞；胎盘；免疫磁珠细胞分选；脐血Isolation and Enrichment of Hematopoietic Stem/ Progenitor Cells from Human Placenta TissueAbstractThe aim of this study was to establish the standard protocols for isolating and enriching hematopoietic stem/ progenitor cells (HSPC) from human placenta tissue (PT). Single-cell suspension from of human PT was prepared by mechanical method combined with collagenase

3、 digestion. Mononucleated cells (MNC) derived from PT were separated by hydroxyethyl starch (6% HES), then the three cell subsets of different immunophenotypes (CD34-,CD34+CD38-, CD34+CD38+) contained in MNC were isolated by Magnetic Activated Cell Sorting (MACS). The cell immunophenotype of each sorting steps was analyzed by flow cytometer (FCM). The cell enrichment and recovery rate of each sorting step were calculated. The results showed that MNC could be harvested up to (12.303.51) 108 from

4、a single-cell 3suspension of human PT by mechanical method and collagenase digestion, no significant difference existed as compared with umbilical cord blood (UCB) initial sample (8.865.38) 108, but the percentage of CD34+ cells in MNC of human PT was (3.932.31)%, much higher than that in UCB (0.440.29)% (P90% ） 。MNC 细胞样品进行 FCM 分析，并作为磁式分选的起始样品。脐血按 11 的比例加入 Hank 稀释后，同上述 6% HES 法分选 MNC。CD34细胞及其亚群的免疫磁珠分选 6按照免疫磁珠细胞分选试剂盒推荐的分选策略，分选胎盘和脐血 MNC 为 CD34+和 CD34-细胞组分，进而再将 CD34+细胞组分分选为 CD34+CD38+、CD34+CD38- 2

5、个细胞亚群。细胞样品的流式细胞术分析调整待测样品细胞浓度到 1106/ml，于含 20 l 相应荧光标记单克隆抗体（CD34-PE、CD38-FITC）的上样管内加入 100 l细胞悬液，混匀，室温避光静置 20 分钟。每管加入 2 ml RBC 裂解液，混匀，室温静置 10 分钟， 180g 离心 5 分钟，弃上清，重新悬浮细胞。每管加入 2 ml 含 0.1 NaN3 的 PBS,混匀， 180g 离心 5 分钟，弃上清，再悬浮细胞；每管加入 0.5 ml 1的多聚甲醛，混匀，2-8避光放置，逐一上机分析。绝对计数则将细胞样品置于含微球的 TruCOUNT 管，其样品制备方法按试剂盒（ProCOUNTTM Progenitor Enumeration Kit）说明进行。采用Cell Quest 软件对标记样品进行检测分析。单个核细胞和 CD34+细胞绝对计数用 ProCOUNT 软件采集（每管采集 2104 个细胞）和分析。MNC 及 CD34+细胞的回收率和富集度按下面公式计算 6：CD34+(MNC)细胞回收率（%）=分离产物的总细胞数产物的 CD34+（MNC）细胞纯度/起始标本 CD34+（MNC）细胞总数7100%CD34+(MNC)细胞的富集度（%）=分离产物中CD34+（MNC）细胞数/分离产物的总细胞数100%统计学分析实验数据采用统计软件 SPSS for Windows 10.0 进行处理。如方差齐，采用 t 检验对各组样本之间进行两两比较；如方差不齐，则采用 t 检验。结果胎盘组织 MNC 数及 CD34+细胞百分率结果见附表。单个胎盘和单份脐血所含 MNC 数差异无统计学意义(P0.05)，而 CD34细胞所占的百分率两者比较有显著性差异（P0.05)。CD34细胞的回收率分别为（51.19.8 ）和（ 60312.3），两者无显著性差异(P0.05)。免疫磁珠分选（MACS ）CD34细胞的富集度和回收率如附图所示，胎盘和脐血 MNC 经 MACS 分选后 CD34细胞组分的富集度分别为（73.414.1）和（78.512.0），CD34细胞回收率分别为（52.7117 ）和（61.95.8）。胎盘和脐血比较，细胞纯度和回收率均无显著性差异

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