人胃癌血管特异性结合多肽的体内筛选及其三维结构模拟的初步分析

1、1人胃癌血管特异性结合多肽的体内筛选及其三维结构模拟的初步分析作者：郅敏，肖高铿，郅慧，董蕾，乔泰东，樊代明，吴开春 【关键词】 胃癌 【Abstract】 AIM: To identify and analyze a peptide binding specifically to blood vessels of human gastric cancer by phage displayed C7C peptide library in vivo and to model its three dimensional structure of the peptide by computer. METHODS: Animal models were established using subrenal capsular assay (SRCA) in immunosupressed mice implanted with human gastric cancer xenografts. The phage displayed C7C peptide library was injecte

2、d intravenously into mice. After 4 rounds of selection, 14 clones were picked up randomly and sequenced individually. The homing ability to human umbilical vein endothelial cells (HUVEC ) of peptide CGNSNPKSC was determined by cellELISA, with SGC7901, Eca109, LoVo and HepG2 cells as control. Its three dimensional structure of peptide CGNSNPKSC was also established by computer modeling techniques. RESULTS: Fourteen clones were obtained and they displayed two kinds 2of peptides. The binding abilit

3、y of a cyclic peptide of CGNSNPKSC toward HUVEC was higher than that of SGC7901, Eca109, HepG2 and LoVo cells. The three dimensional structure of the peptide of CGNSNPKSC was modeled successfully. CONCLUSION: The peptide of CGNSNPKSC has high binding ability to HUVEC and its stable structure and highly hydrophilic character help it form a flexible epitope of antigen. The peptide of CGNSNPKSC can be used in target therapy of tumor angiogenesis. 【Keywords】 gastric cancer; phage displayed peptide l

4、ibrary; angiogenesis; peptides; structure modeling 【摘要】 目的: 利用噬菌体随机环七肽库在小鼠肾包膜下荷人胃癌模型体内筛选能够与人胃癌血管内皮细胞结合的特异性分子，对其多肽进行计算机空间结构模拟分析. 方法：制备免疫抑制小鼠肾包膜下人胃癌移植瘤模型，用随机环七肽库在其体内进行 4 轮筛选，对随机获得的 14 个克隆进行测序. 通过细胞 ELISA 检测所得到的特异性小肽在脐静脉内皮细胞（HUVEC） ，SGC7901，LoVo，Eca109 及 HepG2 细胞系上的结合能力. 并通过计算机分子模拟多肽 CGNSNPKSC 的空间结构. 结果：成功获得14 个噬菌体克隆，并呈现出 2 种氨基酸序列，其中多肽CGNSNPKSC，相比于对照细胞 SGC7901, LoVo, Eca109, HepG2，其同 HUVEC 结合能力明显增强. 利用计算机技术成功地3模拟并分析了该多肽的空间结构. 结论：多肽 CGNSNPKSC 同血管内皮细胞结合能力较强；空间结构稳定，是一个高亲水多肽，更容易形成折曲的抗原表位，很有可能是一个极具肿瘤血管靶

5、向治疗前景的多肽. 【关键词】 胃癌;噬菌体随机肽库;血管生成;多肽; 结构模拟 0 引言 大量实验1,2 证实，肿瘤生长、转移和预后均与肿瘤血管关系密切，采用肿瘤血管抑制治疗有以下几个明显优势：血管内皮细胞基因稳定，不易产生耐药性；毒副作用少，可长期用药；一种药物可用于多种肿瘤；无遗传毒性，不造成继发恶性变，利于长期使用. 因此寻找肿瘤血管特异表达分子进行特异性肿瘤血管治疗具有十分重要的意义. 采用噬菌体随机肽库技术，可在欲筛选的靶标分子结构不明确的情况下，筛选出一些能与靶分子结合的特异性多肽3,4. 我们应用噬菌体随机肽文库筛选技术，在荷胃癌瘤组织的免疫抑制小鼠模型体内筛选能够与胃癌移植瘤血管内皮相结合的多肽，旨在为胃癌血管抑制治疗提供有效的作用靶点. 1 材料和方法 1.1 材料 1.1.1 肽库噬菌体随机环七肽库（Ph.D.-C7CTM Phage display peptide library）：购自美国 New England Biolabs 公司，其滴度为 1.51013 噬斑形成单位（pfu） ，多样性为 2.7109 transformants,在其插入随机七肽序列两

6、端各添加一个半胱氨酸4（Cysteine,C） ，这两个半胱氨酸形成二硫键，从而使随机七肽的空间结构相对稳定. 宿主菌为大肠杆菌 E.coli 2738. 测序引物（96g sequencing primer）序列为: 5HOCCC TCA TAG TTA GCG TAA CG3. 1.1.2 细胞系、动物及标本人胃腺癌细胞系 SGC7901、人结肠癌细胞系 LoVo、人食管癌细胞系 Eca109 与人肝癌细胞系HepG2 均为第四军医大学西京医院消化病研究所保存 . 正常人脐静脉内皮细胞(HUVEC)按参考文献 5 自行分离培养. BALB/c 小鼠，20 只，雌雄不拘，体质量 2022 g，由第四军医大学动物中心提供. 标本均来自西安交通大学第二医院普外科胃大部切除或全胃切除，术前经活检，本院病理科确诊为胃低分化腺癌. 1.1.3 其他试剂 RPMI 1640 培养基（Gibco 公司） ；胎牛血清（Hyclone 公司） ；HUVEC 培养液（Cell Applications 公司） ；抑蛋白酶肽（aprotinin） 、亮抑制肽（leupeptin） 、苯甲基磺酰氟（PMSF

7、） 、5溴 4氯 3吲哚 D半乳糖苷（ Xgal）和异丙基 D硫代半乳苷（IPTG ）(Sigma 公司)；辣根过氧化物酶标记的抗噬菌体 mAb(HRPantiM13)（Pharmacia Biotech 公司）. 1.2 方法 1.2.1 噬菌体随机环七肽库的体内筛选和测序参照文献6制备环磷酰胺（CTX）免疫抑制小鼠肾包膜下移植瘤小鼠模型（SRCA） ，将手术过程中获得的胃癌组织切割成 1 mm1 mm2 mm 大小，植入小鼠肾包膜下. 术后第 6 日，戊巴比妥钠 150 5mg/kg 腹腔注射麻醉小鼠，750 mL/L 乙醇浸泡 5 min 后，尾静脉内注入 11011 pfu 的噬菌体环七肽库，其余步骤同文献6. 10 h 后长出蓝色噬斑后，随机挑取约 250 个分隔良好的蓝色噬斑，分别加入 5 mL LB，37，250 r/min 扩增 12 h 后进行噬菌体纯化. 纯化后的噬菌体经滴定计数后，以与前次相同的滴度注射入小鼠，用于再一轮筛选，如此重复 4 次. 将第 4 轮淘筛后的噬菌体液不经扩增，直接感染 E.coli 2738 铺到 LB 琼脂糖平皿上，10 h 后随机挑取分

8、隔良好的 14 个蓝色噬斑，加入 2 mL LB 培养液中，37 振摇4 h，送上海生工公司进行测序 . 1.2.2 细胞培养及 ELISA 1.2.2.1 细胞培养 SGC7901, LoVo, Eca109 和 HepG2 细胞系均按常规进行细胞培养. 取健康顺产妇脐带按文献5分离HUVEC，培养于 HUVEC 培养液中，并经抗人 CD31 mAb 染色证实分离细胞纯度为 90%以上. 实验所用的 HUVEC 均使用传一代细胞. 1.2.2.2 细胞 ELISA 检测全部培养细胞接种于 96 孔板至终密度为1104/孔，1 g/L 戊二醛固定细胞， 10 g/L BSA 封闭过夜；加入11011 pfu 的呈现 CGNSNPKSC 多肽的噬菌体，37 孵育 2 h；经 PBST 重复洗涤 3 次，加入 50 L HRP antiM13 mAb（13000） ，37孵育 2 h；PBST 洗涤 4 次后加入 TMB，室温 30 min. 加入 2 mol/L H2SO4 终止反应，自动 ELISA 仪上测A450 nm 值. 以 PBS 作为阴性对照. 以噬菌体随机 12 肽库6（P

9、HD12） （11011 pfu）作为阳性对照，每个样本选取 3 个复孔. 采用公式 S/N=样品平均 A450 nm 值/PBS 组平均 A450 nm 值，其中 S/N2.1作为阳性结果，而 S/N2.1 作为阴性结果. S 代表样本组，N 代表 PBS 组. 1.2.3 多肽的分子模建及预测表位分析采用 GROMACS 3.2软件包，对 9 个多肽进行能量最优化与分子动力学模拟. 整个模拟过程按如下步骤进行：运用最陡下降法(steepest descent method)对多肽进行 2000 步优化计算，以避免做分子动力学时原子间的不合理碰撞；在多肽周围加上 1 nm 厚度的水层，保证其有足够构象变化空间；对溶液状态下的多肽设定 pH=7；在 298 K 的恒定温度下进行 20 ps 的分子动力学模拟(molecular dynamical simulation，MDS)，模拟步长为 1 fs，非键相互作用采用 0.95 nm 的截断值(cut off)，MDS 得到的最后构象作为多肽在水溶液中的分析构象. 全部工作在 RedHat Linux 9.0 操作系统，CPU 为AMD2500 下完成. 2 结果 2.1 筛选和测序 4 轮筛选结束后，对随机挑选的 14 个噬菌体克隆进行测序，其中的 12 个克隆呈现出 CGNSNPKSC 序列，2 个克隆呈现 CPHNLTKLC 序列. 2.2 细胞 ELISACGNSNPKSC 多肽对 HUVEC 结合能力明显高于对 SGC7901, LoVo, Eca109 及 HepG2 细胞，接近于阳性对照噬菌体（Fig 1）. 72.3CGNSNPKSC 多肽的分子结构模拟及预测表位分析分析DMS 的最终构象，如 Fig 2 所示，5 个分子内氢键稳定了结构（其中二硫键是黄色实线，黄色虚线是分子内氢键）. 2 个半胱氨酸残基形成 1 对二硫键结构，限制了分子柔性，形成了一个 螺旋（Fig 3 的白色飘带）与一个 转角（Fig 3 的红色飘带）. 分析该肽的亲水与疏水性，与水接触的极性表面积为 6.932 nm2(693.2 平方埃)，而疏水表面积仅为 3

《人胃癌血管特异性结合多肽的体内筛选及其三维结构模拟的初步分析》由会员油条分享，可在线阅读，更多相关《人胃癌血管特异性结合多肽的体内筛选及其三维结构模拟的初步分析》请在金锄头文库上搜索。