基因水平传递在复合微生物培养中的应用研究——阳离子表面活性剂对pseudomonas putida mt2tol的高分子物质通透性影响初步研究

1、基因水平传递在复合微生物培养中的应用研究 阳离子表面活性剂对P s e u d o m o n a s p u t i d a m t - 2 ( T O L ) 的高分子物质通透性影响初步研究 厉鹅邢新会 ( 清华大学化学工程系生物化工研究所) 1 前盲: 当前在遗传工程、 细胞工程和基因工程方面， 基因转移的研究越来越多地受到人们的关注。 尤其在多种类徽生物的复合培养中，可以通过细胞之间的基因水平传递达到不同功能的微生物 复合培养的目的。例如在环境保护等领域中，对复杂难降解有机物的微生物处理已经成为非常 重要的治理污染的方法之一，而开发难降解有机物的高效分解技术的关键在于提高处理体系的 微生物多样性。实现这一目的方法之一是将已知特殊降解物分解菌引人污染处理系统，并使其 分解能传播于不同种类的微生物， 从而使多种微生物都获得分解污染物的能力。 P . p u t i d 。 细胞内含有高效分解苯，甲 苯， 二甲苯等有机物的T O L 质粒 ( 1 1 5 k 6 ) ， 所以如果能 够将T O L 质粒导出细胞外， 水平传递到异种细菌细胞内并表达，将会增强异种细菌降解甲苯的 能力，这

2、在难降解有机废水处理等环境修复方面具有重大的意义。但由于实验体系的复杂性， 目前这方面研究很少。本研究目的在于通过加人阳离子表面活性剂，利用其与细胞表面的结合 来改变细胞膜结构， 从而改变细胞对大分子物质的通透性，使T O L 质粒的人为析出成为可能， 同时确立使T O L 质粒水平传递进人其它细胞的方法。实验所用阳离子表面活性剂是十二烷基三 甲 基澳化按 ( D T A B ) 。 前期实验证明， 它可与P . p u t i d a 的细胞表面进行作用， 有效地将其控制于 休眠状态。为验证D T A B 对细胞膜的高分子物质通透性的影响，选用异硫氢酸荧光素一 右旋糖昔 ( F D )作为检验试剂。其分子量足够大， 正常情况下很难以进人细胞内，可通过测定荧光强度探 讨细胞膜通透性变化。生物学中常用F D作为向细胞内导基因的模拟高分子物质。为探讨D T A B 对P . p u t i d a m t - 2 细胞的高分子物质通透性影响，本实验针对以下内容进行了研究:1 )分析 D T A B 的加人对细菌增殖产生的影响; 2 )分析荧光素F D 分子量大小和D T A B 的加人对细

3、胞的E D 通透性产生的影响。 2 实验材料与方法: 本研究中 所用培养基组成为T ry p t o n e l O g / L , Y e a s t e x t r a c t 5 g / L , N a C l l O g / L ( L B 培养基) 。实 验所用细菌均经过O v e m i g h t 培养。所有细菌培养均是在2 9 C, 1 0 0 r p m的摇床上进行的。本实验 使用的F D 分子量为4 0 0 0 , 1 0 0 0 0 , 2 0 0 0 0 , 4 0 0 0 0 , F D 均经过高温灭菌处理后使用。 2 . 1 D T A B 加入对细菌增技和细胞外蛋白浓度的影响 分别于细菌开始培养后0 , 3 , 9 , 1 4 小时加人D T A B ，探讨D T A B 对细菌增殖的影响。同时 测定细菌培养3 小时后加人D T A B 前后胞外蛋白浓度变化。用不加D T A B的细菌培养实验作对 比。若不做特殊说明， D T A B 加人培养液的浓度均为1 以 L o 2 . 2 D T A B处理细胞的 F D通透性 变化 在细菌培养3 小时后加入 D

4、 T A B的情况下，分别使用上述四种不同分子量的F D ,测定细胞 外的F D浓度随时间变化，进而分析F D分子量对细胞的F D通透性的影响。选定F D 一 2 0 为基准， 解析 F D的细胞内传递过程。在细菌培养 3 小时后加人 D T A B ,测定细胞外 F D一 2 0 浓度随时间变 化。同时进行不加 D T A B 、只加人 F D一 2 0和培养开始第0时刻加人 D T A B 、之后再加人 F D一2 0 的对比实验。 2 0 0 2 . 3 分析方法 细菌浓度用波长6 6 0 n m光学密度 ( O I 场 )进行测定; 蛋白质浓度测定方法为B i 。 一 R a d P r o - t e i n A s s a y 标准方法; F D浓度测定是通过F D 荧光强度一 F l ) 浓度标准曲线由测定其荧光强度得 -. - -田 礴 一. 一 F Bl M - - FD 2 1 s 一， 日 D 司 仙仙临时叫叨胭咄吐叫 军妇滚侧侧艘长粼目 吐因咖 到。 3 结果与讨论: 3 . 1 D T A B 加入对细菌增殖和细胞外蛋白浓度 的影响 不同培养时间添加 D T

5、A B实验结果表明， D T A B 的加人可以使细菌增殖马上停止， 进人 休眠状态。因3 小时培养已使细菌增殖到足够 高的细胞浓度，所以在以后的实验中D T A B一 般在培养3 小时后加人培养体系内。细胞外蛋 白质在 D T A B加人前浓度相对很低，加人 D T A B 之后，培养液中细胞外蛋白质浓度急剧 L 升，和不加人 D T A B的对比实验相比处于一 个较高的水平。这一实验表明:蛋白质属于 大分子物质，正常条件下较难析出细胞外， 但加人D T A B 后细胞外的 蛋白 浓度却明显增高 说明D T A B 可以改变细胞对大分子物质的通透 性，使细胞内大分子物质析出细胞外成为可 能。 3 . 2 D T A B处理细胞的 F D通透性变化 因荧光强度与 F D浓度有关，细胞外F D 荧光强度的变化比例代表着细胞外 F D浓度变 化比例。从图 1可以看出，F D一2 0进人细胞 的含量相对比例最大。由于传质最终处于动 态平衡状态，分子过大或过小均影响平衡状 态F 细胞内的通透物质量。由图2 可以看出培 养3小时加人 D T A B的细胞外 F D一 2 0浓度变 化明显大于0

6、时刻加人 D T A B的实验结果。这 是因为细菌浓度不同所致。从图2 还可以看出 加人D T A B 与否对 F D 一 2 0 进人细胞的难易程 度可产生很大的影响。正常条件下 F D一 2 0 是 基本不能进人细胞内的，但在加人了D T A B后 却相对较容易进人细胞，这也证明了D T A B的 确可以改变细胞对大分子物质的通透性，暗 示了人为地使 T O L 质粒体扩散到其他细胞的 可能性。同时由不加人 D T A B时 F D细胞外浓 度基本不变可以说明，细胞表面对 F D不产生 明显吸附作用。 3 . 3 F l ) 向细胞内传质的动力学探讨 2 3 4 5 6 时间( h ) 圈1 四种不同分子，F D进入细胞比例比较 ( 细苗培养 3小时后加入 D T A B ) 一. 一3 小时加人7 r .1 : ! 一. -田寸 川加人D r A B -击 - 不加人口以B MT 0 1 2 3 4 6口7 时间向 图2 不同条件下细胞外 F O相对浓度变化比较 根据以卜 实验结果，可认为在 D T A B 作用下，细胞膜的结构发生变化，出现可让大分子物质 通过的孔;而F D由于受细胞内外浓度差的推动而进人细胞，最后达到一个动态平衡，即进人细 2 01 胞内的速率和析出细胞的速率近似相同。对 F D的传质速率进行解析可知F D 进人细胞的传质过 程符合一级动力学方程，这对下一步深人研究阳离子表面活性剂对细胞的大分子物质通透性影 响有重要的指导意义。 4 结论: 阳离子表面活性剂D T A B 能够改变P . p u t i d a 细胞对高分子物质的通透性， 使细胞进人休眠状 态，同时可使细胞内蛋白质析出细胞外和使细胞外高分子物质 F D进人细胞内。细胞的 F D通透 性与F D分子量大小等因素有关，可用一级动力学模型解析。 2 0 2

《基因水平传递在复合微生物培养中的应用研究——阳离子表面活性剂对pseudomonas putida mt2tol的高分子物质通透性影响初步研究》由会员E****分享，可在线阅读，更多相关《基因水平传递在复合微生物培养中的应用研究——阳离子表面活性剂对pseudomonas putida mt2tol的高分子物质通透性影响初步研究》请在金锄头文库上搜索。