枯草芽孢杆菌植酸酶phyc基因的克隆及其表达研究
145页1、四川大学 博士学位论文 枯草芽孢杆菌植酸酶phyC基因的克隆及其表达研究 姓名:吴琦 申请学位级别:博士 专业:遗传学 指导教师:刘世贵 20040428 四川大学博士学位论文 枯草芽抱杆菌植酸酶 1) 加 基因的克隆及其表达研究 遗传学专业 博士研究生:吴琦指导教师:刘世贵( 教授) 王红宁( 教授) 植酸酶作为一种绿色添加剂,已日益广泛使用于饲料工业中。研究表明, 来源于芽抱杆菌的植酸酶属于中性植酸酶不仅具有较好的热稳定性,有助于抵 抗饲料制粒或者膨化过程中引起的酶失活,而且其酶促反应的p H有效作用范 围在6 . 5 -7 . 5 之间, 适合用于消化道呈中性的鲤科鱼类, 以及在单胃动物中p H 值呈中性的肠道段中表现酶活力。目前,国内外尚无商品化的中性植酸酶投入 市场。 本研究从己筛选获得的中性植酸酶产酶菌株枯草芽抱杆菌 ( B a c i l l u s s u b t i l i s ) W H N B 0 2 出 发, 根据G e n B a n k 上的芽抱杆菌p h y C 基因 序列设计了 一对引物,采用 P C R法获得芽抱杆菌植酸酶的全长 p h y C 基因,
2、并将其克隆到 p U C 1 8 一载体。序列分析表明,该基因全长 1 1 5 2 b p ,编码一个3 8 3 氨基酸的多 肤。通过与G e n B a n k 中登录的其他6 个植酸酶基因的核酸序列和氨基酸序列进 行比较,建立了系统进化树,结果表明:所有芽抱杆菌植酸酶具有较高的同源 性,来源于7 株芽抱杆菌的植酸酶在遗传上分为两大类。利用在线生物信息学 数据库及生物软件对本基因进行了信号肚序列、N - 糖基化位点、密码子偏爱性 等分析, 并对其二级结构、 疏水区和三维结构进行了预测。 B . s u b t i l i s W H N B 0 2 植酸酶 p h y C基因序列及其氨基酸序列在 G e n B a n k中登录,登录号分别为 A F 2 2 0 0 7 5 和 A A 0 4 3 4 3 4 . 1 根据芽抱杆菌植酸酶p h y C 基因序列及大肠杆菌表达载体P E 丁 一 3 0 b ( +) 多克 隆位点序列, 采用P C R 法获得不含有信号肤序列的植酸酶p h y C 基因的非融合和 融合表达片段。经克隆及序列测定后,构建了带有 T 7 1 a c 启动子的
3、大肠杆菌的 植酸酶p E T 3 0 N F p h y C 和p E T 3 0 F p h y C 表达载体, 并转入大肠杆菌B L 2 1 ( D E 3 ) , 实 四川大学博士学位论文 现了有生物学活性的表达。 研究了诱导温度、 I P T G 诱导浓度和乳糖诱导浓度对 植酸酶非融合和融合表达的影响,并对表达目的蛋白的可溶性进行了分析。结 果表明,非融合表达在3 7 和3 0 表达产物以包含体形式存在,无表观酶活, 而 2 5 诱导的表观酶活最高;融合表达载体在 3 7 表观酶活较低,而 3 0 诱 导的表观酶活最高。表明降低诱导温度有助于实现目的蛋白的可溶性表达。两 种表达方式的工 P T G 最适诱导浓度为0 . 4 m m o l / L ,乳糖最适诱导浓度为1 YO,但 乳糖诱导表达的时间推迟 1 -2 h , 且表达量不及I P T G 的诱导。 S D S - P A G E 分析表 明, 非融合和融合植酸酶的表达量分别约占菌体总蛋白的1 3 %和1 5 %, 分子量 分别为4 0 . 1 3 K D 和4 3 . 2 7 K D o 为实现芽抱杆菌植酸酶p h
4、y 基因的分泌表达, 以及由酵母翻译后加工可能 带来的酶学性质改善,首次进行了该基因在酵母中的表达研究。根据芽抱杆菌 植酸酶p h y c 基因序列及毕赤巴斯德酵母表达载体p P I C 3 . 5 K 和P P 工 C 9 K 多克隆位 点序列, 采用P C R 法获得不含有信号肤序列的植酸酶p h y 基因胞内表达和分泌 表达片段。经克隆及序列测定后,构建了重组表达载体 p P I C 3 . 5 K p h y C和 p P I C 9 K p h y C ,经 B g l 1 1 线性化后,电转化毕赤巴斯德酵母宿主菌 G S 1 1 5 。经 MD和MM平板筛选、P C R检测和酶活性测定,获得阳性重组酵母,首次在毕 赤巴斯德酵母中实现了有生物学活性芽抱杆菌植酸酶的胞内表达和分泌表达。 S D S - P A G E分析表明,胞内植酸酶表达量约占菌体总可溶性蛋白的2 4 , 分子 量为4 2 . 0 1 K D;而分泌表达的植酸酶为5 3 . 5 K D 和5 0 . 9 K D 两种分子量的蛋白, 去糖基化试验证明这是由于产物糖基化程度不同引起的糖蛋白。用麦芽汁半合 成培养基
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