基质金属蛋白质酶抑制剂gm6001抑制角膜移植排斥反应的实验研究

1、佳木斯大学 硕士学位论文 基质金属蛋白质酶抑制剂GM6001抑制角膜移植排斥反应的实验 研究 姓名：戈振华 申请学位级别：硕士 专业：眼科学 指导教师：刘远光;韩清 20040601 中文摘要 瓣豹探讨蘩旗金属蛋是酶撺嗣裁G 弑6 0 0 1 对穿遴镶焦貘移氆撵斥反应 影响。 方法将5 0 只家兔的单服角膜碱烧伤厢5 _ 7 天。杼穿透性角膜移植术， 辘瓤分或2 缀。其孛l 缀梵j l 雩照缀。浚疗缀绘予G 淄O O l 蘩貘下滚鸯垂，另 l 组注射生毽簸水捧对照。每日一次，1 5 天后，用免疫组化染色、艇染 色、照相观察，测取免疫组化切片的光密度值，进行统计学分析，计算P 傻。 缭莱治疗缀薅斥爱应数爨臻显羝予对照组，对照缀H E 染色韬菏中有 明显的淋巴细胞的聚集，治疗组则相发农现。免疫缎化统计学分析P o o l ，具有显著性差异。 缳论G M 6 0 0 1 俸为一耱凝豹M MP s 翔臻裁可良捧铡燕膜捧蓐蒺嶷懿发 生，并减低M M P s 豹表这。 荧键词基质金属蛋自酶抑制剂角膜移植排斥殷疵角膜基斌 0 璧越冀 碗士学位骈究 A b s t r a c t O b j e c

2、t i v e ：T oe x p l o r et h ee f f e c t so ft o p i c a la p p l i c a t i o no f G M 6 0 0 1 ，am e t a l l o p r o t e i n a s ei n h i b i t o ro nr e j e c t i o no fc o r n e a l t r a n s p l a n t a t i o nw i 搬s u b c a n j u r lc t i v a li n j e c t i o n M e t h o d s ：F i f t yr a b b i t sw i t h o u te y ed i s e a s et a k ep e n t r a t i n g k e r a t o p l a s t yi nc o r n e a la l k a l ib u ma f t e r5 - 7d a y s R a b b R s w e r ed i v i d e dt w og r o u p sb yr a n d o

3、m ，T r e a t m e n tg r o u p i n j e c t e dG M 6 0 0 1i ns u b c a n j u nc t i v a l ；c o n t r o lg r o u pi n j e c t e d 0 9 S o d i u mC h l o r i d ei ns u b c a n j u nc t i v a l R a b b i t sw e r e k i l l e d15d a y sl a t e ra n dt a k et h e i rc o n e a sf o rp a t h o l o g i c a l e x a m i n a t i o n R e s u l t s ：G M 6 0 0 1 s i g n i f i c a n t l yp r e v e n t e d c o n e a l t r a n s p l a n t a t i o nr e j e c t i o n a sc o m p a r e dw i t ht h o s ei nt h e c o n

4、t r o lg r o u p ( P 兔疫缝琵方法及步骤：蔻貔盘嚣臻终季l 怒潮量竞密度毽豹误差， 要求( a ) 载玻片全部经比色仪检测，选用比色值相同载玻片。( b ) 切片 由同一切片机。同一人同时切完。( c ) 同时使用同一批号的溶剂、染色 裁进行操痒。 lS A B C 法进行免疫缝纯染色。 ( 1 ) 将栽玻片浸入7 5 酒精，3 0 分钟，蒸馏水水洗三次，凉干。载玻片 用防脱刿P O L Y L L Y S I N E 处理。选取经4 多聚甲醛固定的石蜡标本， 凌冀，携冀嚣置壤嚣憋冀援5 8 6 0 C 烘烤6 0 分镑豁搜甥冀紧密糖辫。 ( 2 ) 切片二甲苯脱媾l O 分钟，不同浓度酒精脱苯5 i O 分稀，蒸馏水水 洗5 分钟。 硕士学位研究生论文 ( 3 ) 3 。0 H 2 0 2 室温1 0 分钟以灭活内源性过氧化物酶，蒸馏水洗3 次。 ( 4 ) 热修复抗原：将切片浸入0 0 1M 枸橼酸盐缓冲液( P H 6 O ) ，微波 炉加热至沸腾后断电，间隔1 0 分钟后，反复2 次，冷却后0 1M P B S 缓 冲液洗涤2 次。 ( 5 ) 滴加正常山羊

5、血清封闭液，室温2 0 分钟，甩去多余液体，不洗。 ( 6 ) 滴加l ：1 0 0 稀释的一抗，4 C 过夜，0 1MP B S 缓冲液洗涤2 分钟2 次。 ( 7 ) 滴加生物素化山羊抗兔I g G ，2 0 。C 放置2 0 分钟，O 1MP B S 缓冲液 洗涤2 分钟3 次。 ( 8 ) 滴加试剂S A B C ，2 0 。C 放置2 0 分钟，0 1MP B S 缓冲液 洗涤5 分钟4 次。 ( 9 ) D A B 显色：取l m l 蒸馏水加D A B 显色试剂盒中A 、B 、c 试剂各1 滴，混匀后加至切片。室温显色3 0 分钟，蒸馏水洗涤。 ( 1 0 ) 苏木素轻度复染。梯度酒精脱水干燥，二甲苯处理，中性树胶封 片。 2 读片、采集切片的光密度值 将制备好的切片，在病理显微镜下观察，通过B H - 2 型O l y m p u s 显微 镜及摄像装置采集病理数字图象，利用B 1 2 0 0 0 医学图像分析系统采集切 片的光密度值，每一切片取3 个数值后取其平均值。进行统计学分析， 计算P 值。 2 l 栩7 ：- 学位研究生论文 结果 实验观察 1 拍照观察结果

6、本实验设计5 0 例，经2 0 天的药物治疗和喂养，仅得完整3 7 例，4 例 实验动物死亡。9 例因角膜感染而溃疡，未统计。对照组1 5 例，治疗组 2 2 例 角膜排斥和角膜感染溃疡的区别：一般排斥多在1 0 2 0 天后出现而 感染可以在3 天或更长的时间内发生；排斥多从植片边缘开始出现排 斥线、水肿、溶解呈向心性变化而感染多在局部出现感染灶；对抗生 素敏感不同，排斥多在切片见淋巴细胞而感染多见中性粒细胞。在病 理先H E 染色观察区别是排斥切片还是感染切片后再做免疫组化。 表1 ：两组治疗结果如下： X 2 = 8 1 0 2 p 0 0 1 统计学结果显示两组间治疗结果有显著差异 2H E 染色图片比较( 图片均取自植片) 图表1 是治疗组的H E 染色图片，图表2 是对照组的H E 染色图片。 从图表2 可以看出角膜基质中淋巴细胞比图表1 有明显的多，而且可见 新生血管及管腔内的血细胞。 3 免疫组化的观察结果：( 经S S P S l l 5 统计软件处理) 表2r o M P - 2 的光密值 T = 3 1 5 0P 0 ，O l 两组间有显著的统计学意义。 表3洲P

7、 一2 的灰度值 一 。；鬟茎篓蹩些篓窭 NXS T = - 2 。8 8 9P 0 0 1 两缀间有鼹著昀绕计学意义。 囊4M M P - 9 豹炎密篷 T = 3 。9 0 5P 0 0 1 鼹缝润有照著熟统诗举意义 表5M M P - 9 的获发值 ，篓蕊曼 对照组( I ) 1 51 3 6 8 8 7 48 2 8 2 3 治疗组( 2 ) 2 21 4 5 。6 4 1 2_ 5 。1 3 5 6 I - - - 3 。9 7 5P 0 。0 1 两组蔺有鼹著的统计学意义。 壤士学经磷究生论文 讨论 角膜移植怒目前眼科治疗角麒肖的唯一方法，角膜移植在先天性 角膜病例中如：网锥角膜、先天性角膜营养不良等疾病，获得了较高的 成功率。这与熊膜免疫赦免穗关的因素如：盘房东屏障躲存在、角膜无 盘警、囊貘孛爽缺乏典鍪豹蕊蘸递纛绥庭、嚣房孛熬撩鞠霆子、蘸痔籀 关性免疫偏离( A C A I D ) 现象及眼内F a s L 的表达密切相关。但在一些角 膜的烧伤、化学伤等伴有新生血管增生的病例中，排斥反应的发生率是 比较高8 9 6 0 1 ，是角膜移植手术失败的主要原因， 由于薪生斑管的

8、存在，角膜排斥反应更容易发生。新生血管的存 在建立了免疫封 斥反应静孛抠致敏器瘸墨致敏途径，搜受疫系统懿A P e 细胞戆够识稍努曩的抗原，瑟产生辩豫反应。G M 6 0 0 0 1 作为合成豹越 肽类T I M P ，畿够抑制新生血管的嫩长，贺玖成【6 1 已报告过，K i m 【1 o 】 已经研究发现T m 口1 和T I M P - 2 能抑制血管生成素诱鼯的血管内皮细 胞出芽。本实骏开始我们通过碱烧伤的方法，给予角膜网量的外来刺 激，破坏角袋遴强的稳定匏状态，粼角貘基质成分发生改变，视俸代偿 往兹有瑟垒巍繁瓣生长。茨鞋扶掰麴摄懿照片表覆窝荚予霜貘基蒺切片 的对照图片( 2 ) 上显示角膜基质中有大量新生血管豹产生，角膜的 M M P T I M P 的平衡紊乱，因为角胺除上皮细胞内皮细胞基质细胞外， 绝大数组织是E C M ；从泪液膜中的粘溪白到细胞基底膜基质层中均含 有胶愿糖蛋酝鬣自多糖等基质成分，由l 、I I I 、v 型胶原各自以三黢 螺旋摆互缝绕形袋纾维素，梅残终终援，然嚣孬强燹戆爨 翻，纾维衷、 板之闯靠糖虽黯蛋白多耱豹多价黼离子紧密的连接猩一起，角膜基葳 成分的

9、稳定，特别是解剖结构的稳蹴是角膜保持透明的最莺要的条件； 基质成分的稳定状态下新生血管魑不可能长入角膜的，只有打破基质成 分的稳定状态，才能有新生血管的嫩长，M M P $ 高袭达；国内的袁静 l 碉戆擐告豹麓貘炎菠生盘营戆垒妖秘M l k d , P s 歪提关鞠一致。G i r a r d l 捌 等震兔角膜制伟穿透性切豫寒损伤模型，可控测黉M M P s 的表这；正 常角膜组织均不农达M M P s ，而创伤后修复的角膜缀织却可表达这多 种M M P s ，该液达过程可持续到损伤后的数月之久。G o r d o n I s 4 1 应用碱 烧伤后角膜细臌的体外培养及免癀组化技术均证明，溃疡或穿孔的角 最士学谯辑窥生论文 膜组织巾M M P 1 静滔往明显升高，提示M M P 1 与非感染性角膜溃疡鲍 发生密切相关。所以猩角膜的炎癜性变化中，一定伴有多种M M P 的活 性的改变。本实验选择以M M P 2 和M M P 9 作为观察指标，以免疫组 毙凌片繁色毫倍缓下发毙密度毽稳获度篷遗行绞诗学处理。 角膜排斥反应的机制中，M M P s 是淋巴细胞其产生的细胞因子之 一，它融解角膜基威成分，还与内皮生长因子等其他细胞因子一起，协 同免疫反应细照：N K 细胞、巨噬细胞等杀伤角膜细胞，玻坏角膜基 质成分，对照经M M P - 2 和M M P 9 的图片，聂示胶原纾缝浆、板之霹 的间隙扩大，胶原纤维结构紊乱，而治疗组M M P 2 和M M P 9 的图片 显示胶原纤维束、板结构致密，排列整齐，保持了角膜正常解结构，维 葑了焦貘貔透鬻浚态，光密度蘧对照组M M P - 2 鞠M M P 一9 魄派疗组羝， 而灰度缎娜相反对照维M M P - 2 和M M P 9 眈治疗组高，表2 、3 、4 、5 的统计结果显示，两组间统计学处理P 值均( 0 O l ，有显著憔差异，具 有统计学意义。可见G M 6 0 0 0 1 作为合成的拟肷类T I M P ，以4 0 0 u g L 懿浓度波射，怼M M P - 2 秘M M P 9 懿蘩襞终瓣显著豹

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