6q16-q23杂合性缺失与nhl发病相关性的初步研究 (2)

1、浙江大学硕士学位论文 1 论论 文文 目目 录录 缩略语 缩略语 2 2 中文摘要 中文摘要 4 4 英文摘要 英文摘要 7 7 正文 正文 11 11 前言 11 11 试剂材料 14 14 第一部分 NHL6q16-q23 杂合性缺失的检测 18 18 第二部分 NHL 肿瘤相关基因的免疫组化检测. 29 29 讨论 45 45 结论 50 50 参考文献 51 51 综述 综述 55 55 致谢 致谢 60 60 浙江大学硕士学位论文 2 缩缩 略略 语语 ALL Acute lymphocytic leukemia B-NHL B-cell non-Hodgkin lymphoma BCL2 B cell lymphoma-2 gene BCL6 B cell lymphoma-6 gene BLIMP-1 B lymphocyte induced mature protein 1 BL Burkitts lymphoma CX43 Connexin43 CGH Comparative genomic hybridization CCNC CyclinC DLBCL Diffu

2、se large B-cell lymphoma DAB 3-3-diaminobenzidine EDTA Ethylenediamine tetra acetic acid FL Follicular lymphoma FISH Fluorescence in situ hybridization GJIC Gap junction intercellular communication GC Germinal center HTLX Human homologue of the Drosophila tailless gene HDAC2 Histone deacetylase 2 LOH Loss of heterozygosity 浙江大学硕士学位论文 3 MZL-MALT Extranodal marginal zone B-cell lymphoma of MALT type MLI Mean labeling index NHL Non-Hodgkin lymphoma PCR Polymerase chain reaction PBS Phosphate-buffer

3、ed saline PTPRK Receptor protein tyrosine phosphatases PCNSL Primary central nervous system lymphoma RMD Region of minimal deletion RNAH RNA Helicase SSLP Single strand length polymorphism SDS Sodium dodecyl sulfate TSG Tumor suppress gene T-NHL T-cell non-Hodgkin lymphoma TEA Triethylamine acetate TBE Tris-borate EDTA electrophoresis buffer TCBA1 T-cell lymphoma breakpoint associated target 1 浙江大学硕士学位论文 4 6q16-q23 杂合性缺失与 NHL 发病相关性的初步研究 6q16-q23 杂合性缺失与 NHL 发病相关性的初步研究 浙江大学医学院浙江大学医学院 病理学病理学 硕士研究生硕

4、士研究生 杨杨 敏敏 导导 师师 周周 韧韧 副教授副教授 摘摘 要要 肿瘤抑制基因(tumor suppressor genes, TSGs)的缺失或失活在肿瘤的发生中起关键作用。 细胞遗传学研究表明几乎所有的肿瘤细胞都存在染色体片段的非随机丢失，在丢失的片段中 往往包含着某些与肿瘤发生相关的基因。杂合性缺失(loss of heterozygosity, LOH)是指一个位 点的两个多态性等位基因中的一个出现缺失。肿瘤抑制基因的杂合性缺失导致肿瘤的发生， 利用染色体上高度多态的微卫星标记分析肿瘤抑制基因的杂合性缺失是检测染色体缺失和肿 瘤抑制基因的有效手段。众多研究发现 6 号染色体长臂的缺失在多种肿瘤中常见，比如卵巢 癌（6q13，6q21，6q24-27） ，肝癌（6q14-22 及 6q26-27） ，胶质母细胞瘤（6q16.3-21 及 6qtel） 等实体瘤。同样 6q 缺失（尤其是 6q166q27）也在非霍杰金淋巴瘤(non-Hodgkins lymphoma, NHL)等造血系统肿瘤中常见，且与预后差有关。这提示了在 6 号染色体长臂上存在 TSGs。 在淋巴瘤中报

5、道较多的 6q 区段有三个最小缺失区(region of minimal deletion, RMD) 6q21， 6q23 和 6q25-q27，推测这些区段存在肿瘤抑制基因。本研究选取 6 号染色体长臂的 6q16-q23 区段约 60Mb 内的 8 个微卫星标记进行 LOH 分析， 希望筛查与非霍奇金淋巴瘤发生相关的肿 瘤抑制基因，同时采用免疫组化方法检测 6q16-q23 上的 FYN，CX43，CD24 基因产物的表 达和淋巴瘤相关基因 BCL2，BCL6 的表达，结合细胞增殖指标 Ki67，研究 6q16-q23 的 LOH 与该区段上已知基因的相关性及其与 NHL 发病可能存在的相关性， 同时也初步探讨该区段中 可能存在的与 NHL 发病相关的未知基因。 材料与方法材料与方法 1 材料材料 收集 1997-2003 年我医学院附属医院及省内其它医院的 NHL 标本 39 例（6q16-q23 杂合 性缺失检测） 和 61 例 （免疫组化检测） ， 全部标本经中性福尔马林固定、 常规石蜡包埋、 45m 连续切片， 除常规 HE 染色外， 采用 LCA(2B11, DAKO)

6、、 CD20(L26, DAKO)、 CD45RO(OPD4, DAKO)免疫组化 S-P 法标记淋巴细胞亚群，根据肿瘤的免疫表型，划分为 B-NHL 或 T-NHL， 按照 2000 年 WHO 关于淋巴及造血系统肿瘤分类标准对所有病例进行分类。 在 39 例和 61 例 两组样本中分别有 34 和 54 例 B 细胞性 NHL（B-NHL）中，结外边缘区 B 细胞淋巴瘤，粘 浙江大学硕士学位论文 5 膜相关型（MALT-MZL）15 和 27 例，弥漫大 B 细胞淋巴瘤(DLBCL)13 和 20 例，滤泡淋巴 瘤(FL)6 和 7 例；5 和 7 例为 T 细胞性 NHL(T-NHL)。 采用的免疫标记有淋巴细胞分型标记：LCA(2B11, DAKO)、CD20(L26, DAKO)、 CD45RO(OPD4, DAKO)；6q16-q23 相关基因标记：FYN(F9500-04, Santa Cruz),CD24 (C-20, Santa Cruz),CX43(D-7, Chemincom) ； 淋 巴 瘤 相 关 基 因 标 记 ： BCL2(124, DAKO),BCL6(

7、PG-B6P, Santa Cruz)；细胞增殖性标记 Ki67(Ki-S5, DAKO)。 2 方法方法 （1）经典蛋白酶 K-酚氯仿法抽提肿瘤组织及相应的正常组织 DNA。 （2）选取 6 号染色体长臂的 6q16-q23 区段的微卫星标记 8 个，分别行 PCR 扩增， 产物 95 度预变性 5 分钟，然后在 8加入尿素的聚丙烯酰胺凝胶电泳，银染制胶。比较正常与肿瘤的 等位基因的变化，检测杂合性缺失。 （3）在有变化的标记附近和标记之间筛选基因，选择可能与肿瘤发病有关的基因，从中选出 能在石蜡切片上做免疫组化的基因做免疫组化的检测，观察正常与肿瘤组织上的表达差异。 选有位于 6q1-q23 区段的 FYN,CD24,CX43 三个基因， 在 61 例 NHL 组织切片上行免疫组化检 测。 （4）另外，选择 4 个抗体 BCL2,BCL6, Ki-67 在肿瘤组织中行免疫组化检测。 （5）统计：采用 SPSS11.0 软件，2检验，t 检验以及 Spearmans 相关性分析方法 结结 果果 39 例 NHL 病例中共有 6 例至少一个标记发生 LOH， 发生率为 15.4%， 其

8、中 13 例 DLBCL 中有 4 例发生 LOH， 占 30.8%； 15 例 MALT 中有 1 例， 占 6.7%； 6 例 FL 有 1 例， 检出率 16.7%； 即 34 例 B 细胞淋巴瘤中有 6 例，发生率为 17.6%。在本实验的 5 例 TCL 中没有检测到 LOH。 其中有 1 例 DLBCL 病例显示每个有信息的位点均丢失，提示整个区段或者整条长臂缺失。 6q16-q23 所选的 8 个标记都不同程度检测出 LOH 发生，其中发生率最高的是定位于 6q22.33 的 D6S407，检出率为 13.3%，其次是位于 6q16.1 的 D6S302 发生率为 11.5%以及 D6S1717 定位于 6q16.2 缺失率为 11.1%， , 定位于 6q16.3 的 D6S1580 发生率为 10.5% ,这 4 条 标记均超过 10%； 然后是位于 6q22.31 的 D6S287 有 7.4%发生， 位于 6q16.1 的 D6S300 为 5.9%， 在 6q16.3 的 D6S1709 为 5.6%； D6S1572LOH 发生率分别为 5%，位于 6q23.

9、1。 3 FYN 在大的恶性肿瘤细胞浆表达。 在一些小细胞性淋巴瘤中部分恶性进展的大细胞中 FYN 也呈现表达。61 例淋巴瘤中有 19 例病例表达 FYN，统计显示与肿瘤的恶性程度有关，即在 高中度恶性的淋巴瘤中表达阳性率高于低度恶性淋巴瘤中的表达阳性率。在性别、年龄、部 浙江大学硕士学位论文 6 位等因素中表达无差异。 4BCL2 在滤泡性淋巴瘤中强表达，明显高于 DLBCL 及 MZL 包括 MALT。与 6qLOH 及其 余标记间无相关性。 5BCL6 在 FL 和 DLBCL 中表达比 MZL 包括 MALT 更常见（P0.05, 表 13） 。 2.6 FYN、BCL2、BCL6、Ki67 间及与间及与 6qLOH 间的相关性分析间的相关性分析 各蛋白间用 Spearmans 等级相关性分析发现 FYN 与 Ki67 表达间有相关性（P0.01，表 14） 。 2.7 CD24 及及 CX43 在在 NHL 中的表达情况中的表达情况 CD24 在正常淋巴结表达阳性，但在所选的淋巴瘤切片上无一例表达。CX43 在肝癌组织 上表达，在正常淋巴结与淋巴瘤中无表达。 浙江大学硕士学位论文 35 表 9 FYN 在 NHL 中的表达情况 FYN 蛋白表达 临床病理 例数 例数 阳性率% P 性别 男 36 12 36.4 女 25 7 28 0.658 年龄（岁） =54 33 13 39.4 54 28 6 21.4 0.131 部位 结内 1 9 1 10 0.0461/2 结外胃肠道 2 37 16 44.4 0.034 2/3 结外非胃肠道 3 15 2 13.3 0.8021/3 病理类型 B-NHL MZL包括MALT428 8 28.6 0.5514/5 DLBCL5 19 7 36.8 0.6945/6 FL6 7 2 28.6 0.9984/6 B-NHL 总计 7 54 17 31.5 T-NHL8 7 2 28.6 0.8767/8 恶性度 低度恶性组 30 5 16.7 中高度恶性组 31 14 45.2 0.016 合计 61 19 31.1 统计方法：2检验(P=54 33 12

《6q16-q23杂合性缺失与nhl发病相关性的初步研究 (2)》由会员w****i分享，可在线阅读，更多相关《6q16-q23杂合性缺失与nhl发病相关性的初步研究 (2)》请在金锄头文库上搜索。