手性药物HPLC分析资料

1、第七讲 手性药物的HPLC分析方法 一、概述 分子中含有手性中心的药物为手性药物. 20世纪90年代以来, 药物的光学活性与生 物活性之间的关系引起人们日益重视,手 性药物的研究与开发已成为国内外医药 工作者的一个重要研究方向. n手性药物的研究近二十年来发展速度 较快. 2001年诺贝尔化学奖授予3位 从事不对称反应研究的科学家. 一、概述 n近年来以单一对映体上市的药物比例在增加 . n 1999年 单一对映体药物制剂1150亿美元 占世界药品市场总额32%; n 2001年 单一对映体药物制剂1393亿美元 占世界药品市场总额36%; 预计10年后突破额达2000亿美元 目前利用手性的原理与技术开发新药，已成为 国际医药界的新方向之一. 一、概述 手性药物在我国的市场潜力也很大. 中国目前的药物市场居全球第7位, 居美 国、日本、德国、法国、英国和意大利 之后, 到2010年,中国的药物市场将超越 英国和意大利列第5位. 随着人们对用药安全、高效等方面要 求,手性药物的需求会逐年增长. 一、概述 n1992年,美国FDA发布手性药物指导原则, 要求所有在美国申请上市的消旋体新药,

2、 均需测定其立体异构体组成,并提供报告 说明药物中所含对映体各自的药理作用 、毒性及临床效果. n加拿大、欧共体等也制订了相关的“指 南”. 一、概述 2006年1月,我国药审中心制定 手性药物药学研究技术指导原则 （第二稿） 一、概述 临床应用的手性药物,除天然和半合 成药物外,人工合成药物仍以外消旋体 供药为主,约占全部合成手性药物的 87%以上. 一、概述 尽管手性药物的不同对映体之间 在理化性质方面有许多相似的地方, 药物在参与体内生理过程时涉及到 手性分子或手性环境,则不同的立体 异构体产生不同的治疗效果、副作 用甚至毒性反应. 一、概述 (1) 药物的药理作用两个对映体中主 要由其中的一个对映体产生 不同构型的立体异构体的药理作用也 可能不同,大致可分为以下几种情况: 如S-萘普生的镇痛作用比其R异构体强35 倍. 特布他林的R-对映体的支气管扩张作用比 其S异构体强200倍. 一、概述 (2) 两个对映体具有完全相反的药理作 用 如新型苯哌啶类镇痛药-哌西那朵的 右旋异构体为阿片受体的激动剂,而其 左旋体则为阿片受体的拮抗剂. 右丙氧芬是镇痛药；左丙氧芬是镇咳 药 一、概

3、述 (3) 一个有活性；另一个对映体有 严重毒副作用 镇静药反应停（thalidomide,沙利度 胺）右旋体（R型）有镇静作用,左旋 体（S型)具有胚胎毒性和致畸作用. 17000例以上 一、概述 (4)两对映体药理作用不同,但合并用 药 有利 如降压药-萘必洛尔的右旋体为-受体阻滞 剂,而左旋体能降低外周血管的阻力,并对心脏 有保护作用； 一、概述 抗高血压药物茚达立酮的R异构体具有利尿 作用,但有增加血中尿酸的副作用,而S异构体 却有促进尿酸排泄的作用,可有效降低R异构体 的副作用,两者合用有利. S与R异构体的比例为1:4或1:8时治疗效果最好 . (5) 两个对映体具有完全相同的药理作 用 如普罗帕酮的两个对映体具有相同 的抗心率失常作用. 无需使用单一对映体. 一、概述 消旋体药物？ 单一対映体药物？ 固定比例（非消旋体）对映体？ 一、概述 对手性药物开发 两种对映体药理性质和治疗作用类似或互补； 对映体在体内有明显的外消旋作用或不稳定； 缺少对映体选择性合成途径； 无治疗作用的对映体无毒性或毒性可忽略. 哌甲酯治疗儿童多动症.治疗作用只存在 d-对映体,l-对映体不产生有

4、害的 毒副作用,生产成本较低. 消旋体药物 一、概述 消旋体药物中的药理活性和治疗作用只由单一 对映体产生. n消除（或减轻）原有混旋体药物的副作用； n降低使用剂量； n提高疗效； 故使用单一活性异构体代替外消旋体药物, 已成为当今制药业的趋势. 2003年世界销售额领先前10之一： 降血脂药辛伐他丁、胃酸分泌抑制剂艾美拉唑 单一异构体药物 一、概述 固定比例（非消旋体）对映体药物 为产生最佳疗效需要开发两种对映体 固定比例的非消旋混合物. 茚达立酮是以消旋体形式上市的抗高血压药 .右旋体利尿作用,但引起尿酸滞留, 左旋体 排尿酸作用,因此确定两者比例消除不良反 应,达最佳疗效. 现正研究1：4或1：8混合物. 一、概述 二、手性药物的合成纯度控制 手性药物药学研究的主要任务就 是为药物的筛选与进一步研究提供 足够数量与纯度的立体异构体. 在原料药制备工艺研究时应根据手 性中心的引入方式,采取有效的过程 控制手段,严格控制产品的光学纯度. 二、手性药物的合成纯度控制 光学纯度(Optical purity)： 根据实验测定的旋光度,在两个对映异 构体混合物中,一个对映体所占的百分 数

5、. 1. 直接从起始原料或试剂中引入 （一）合成过程中控制光学纯度 二、手性药物药学研究的基本思路 光学纯度主要取决于以下两个方面 ： （1）起始原料或试剂的光学纯度； （2）后续反应过程是否会影响到已 有的手性中心, 从而产生外消旋化的 可能性及程度. 首先要采用立体专属性的分析 方法严格控制起始原料或试剂的光 学纯度,制定合理可行的手性杂质的 限度. （一）合成过程中控制光学纯度 二、手性药物药学研究的基本思路 1. 直接从起始原料或试剂中引入 其次要根据后续反应的机理,充分 分析后续反应是否会影响已有手性中 心的构型,如可能会产生影响时,应研 究与优化工艺条件,尽量避免或减少 外消旋化的产生. （一）合成过程中控制光学纯度 二、手性药物药学研究的基本思路 1. 直接从起始原料或试剂中引入 最后在进行工艺研究时,对引入 手性中心后的每步反应的中间体中 的立体异构体杂质进行检测,分 析与监测外消旋化的可能性. （一）合成过程中控制光学纯度 二、手性药物药学研究的基本思路 1. 直接从起始原料或试剂中引入 采用立体选择性或专属性的反 应（包括酶催化反应）在分子中引入所 需构型的手性中心

6、,所以终产品的光 学纯度直接取决于该步反应的立体选 择性. （一）合成过程中控制光学纯度 二、手性药物药学研究的基本思路 2. 通过不对称合成 采用手性拆分试剂与外消旋 的中间体或终产品反应生成非对 映异构体,分离纯化得到所需的非 对映异构体,再去掉手性拆分试剂 ,从而得到所需的手性药物. （一）合成过程中控制光学纯度 二、手性药物药学研究的基本思路 3. 消旋体的拆分 控制终产品的光学纯度,采取以下措施： 首先应采用光学纯度尽可能高的拆分试剂 ； 3. 消旋体的拆分 除此之外,采用制备型的手性色谱法来直接分 离对映异构体,从而得到所需的目标化合物. 其次,应尽量纯化与拆分试剂反应所得 的非对映异构体； （一）合成过程中控制光学纯度 二、手性药物药学研究的基本思路 手性药物处方筛选及工艺研究 的重点是通过选择适宜的辅料和 工艺条件,避免引起手性药物立 体构型的转变. （二）选择制剂的剂型、处方与工艺 二、手性药物药学研究的基本思路 例如,研究显示手性药物在溶液状态下立体 构型不够稳定,可发生外消旋化,则不宜选 择注射剂、口服溶液等液体剂型. 二、手性药物药学研究的基本思路 （二）选择制

7、剂的剂型、处方与工艺 选择手性药物制剂的剂型时需要 考虑的重要因素是稳定的pH范围,固 态及液态下构型稳定情况,对光、热 、空气等因素的稳定情况等. 手性药物质量标准的特点是质量控 制项目要体现其光学特征的质量控制. 三、质量研究与质量标准 （一）质量标准研究 1. 研究项目的确定 比旋度 立体专属性的鉴别项 立体异构体杂质检查 立体专属性的含量测定等是反 映药物立体化学特征的检测项目. 如果鉴别和检查项能够反映其光学特征和光学 纯度时,含量测定可采用非立体专属性的测定方 法. 三、质量研究与质量标准 光学异构体杂质限量规定： n对映体无反作用或仅有轻微毒性时： 对映体过量98 n对映体有严重副作用时： 对映体过量99.5 n对映体无活性,但副作用也较轻微时 ： 对映体过量99 三、质量研究与质量标准 根据稳定性研究中手性杂质的变 化情况,判断手性药物的立体构型在各 种环境因素的影响下,以及放置过程中 是否稳定,是否有外消旋化现象的产生 ,从而确定是否需在质量标准中控制这 些手性杂质. 二、手性药物药学研究的基本思路 稳定性研究 （一）质量标准研究 首先应建立灵敏、立体专属性 的光学纯

8、度检测指标,以监测立体 构型的稳定性. 稳定性研究 三、质量研究与质量标准 稳定性研究中采用的手性分析 方法,要进行全面的验证工作,以保 证分析方法的立体专属性. 稳定性研究 三、质量研究与质量标准 n高效液相色谱法 n毛细管电泳法 n气相色谱法 n薄层色谱法 n超临界流体色谱法 n比旋度法 三、质量研究与质量标准 2. 分析方法及其选择 对于光学纯度检查方法的验证, 立体专属性是考察的重点. 立体专属性系指在其它手性杂质 可能共存的情况下,采用的方法能正 确测定出被测物的特性. 三、质量研究与质量标准 3. 分析方法专属性的验证 方法专属性的验证,可采用消旋 体或与对映异构体混和进样的方 式考察对映体间的分离度. 三、质量研究与质量标准 3. 分析方法专属性的验证 三、质量研究与质量标准 2.1 原料药 【性状】项下的比旋度是手性药物的 特征之一,可以说明药品的光学特 征和纯度. 【检查】项下光学异构体的检查是 手性药物重要的质控项目之一. 三、质量研究与质量标准 【含量测定】在鉴别和检查项能够反 映手性药物光学特征和光学纯度时 ,可采用非立体专属性的测定方法. 三、质量研究与质量标

9、准 1. 柱前手性衍生-对映体与手性试剂反应 四、手性药物的手性药物的HPLCHPLC分析方法分析方法 3.手性固定相拆分 2. 手性流动相拆分-手性试剂加入流动相 中 直接法 手性流动相添加剂法（CMPA） 手性固定相法（CSP） 引入“手性识别试剂”或“手性环 境”（手性固定相、手性流动相添加 剂）至色谱系统中. 四、手性药物的手性药物的HPLCHPLC分析方法分析方法 间接法：又称手性试剂衍生化（CDR） 四、手性药物的手性药物的HPLCHPLC分析方法分析方法 对映体混合物以手性试剂作柱前衍 生,形成一非対映异构体对,使药物对映 体间呈现理化特性的差异,然后以常规 固定相分离 测定. 均以现代HPLC技术为基础,并引入 不对称中心,不同的是间接法（手性衍生法 ）是将其引入分子（溶质）内，而直接 法（手性流动相添加剂法、手性固定相法） 引入分子间. 四、手性药物的手性药物的HPLCHPLC分析方法分析方法 直接法和间接法共同特点 引入手性环境使对映异构体间呈现物理特性的 差异是手性HPLC进行光学异构体拆分的基础. 色谱柱：Chiral-AGP (100mm4.0mm) 流动相：含0.5异丙醇的20mM醋酸铵 缓冲溶液（pH4.1，醋酸盐总浓度约 110mM） 流 速：1mL/min 检测波长：225nm

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