抗体检测技术与类风湿因子

单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,#,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,单击此处编辑母版标题样式,#,抗体检测技术与类风湿因子,抗体检测技术与类风湿因子,第1页,抗体检测技术,免疫酶技术,免疫荧光技术,凝集反应,沉淀反应,补体结合试验,放射免疫测定,蛋白印迹,免疫共沉淀,亲和力测定,抗体检测技术与类风湿因子,第2页,凝集反应,凝集反应是指颗粒抗原与对应抗体结合反应出现可见性现象颗粒抗原如完整细菌、红细胞等与对应抗体相混合，在一定条件下出现凝集凝集反应中抗原称为凝集原，抗体称为凝集素抗体检测技术与类风湿因子,第3页,沉淀反应,1,、絮状沉淀反应,2,、环状沉淀反应,3,、双向扩散,4,、单向免疫扩散,抗体检测技术与类风湿因子,第4页,双向扩散法操作：,生理盐水配制,1%-5%,琼脂，取,4mL,倒在显微镜用载玻片上，凝固后打孔，中心孔滴入抗原，外周孔滴入抗体用于测定抗体效价，中心孔滴入抗体，外周孔滴入抗原，用于检测抗原存在和定性抗原抗体检测技术与类风湿因子,第5页,抗原抗体为单一体系时，抗原浓度不一样，沉淀弧特征不一样：,抗原抗体为多体系时，出现沉淀弧有多条，彼此互不干扰。

抗体检测技术与类风湿因子,第6页,酶联免疫吸附测定试验,(ELISA),Enzyme linked immunosorbent assay,抗体检测技术与类风湿因子,第7页,试验原理,ELISA,利用了免疫反应高度特异性和酶促反应高度敏感性检测抗原或抗体,使抗原或抗体结合到某种固相载体表面，并保持其免疫活性,使抗原或抗体与某种酶连接成酶标抗原或抗体，这种酶标抗原或抗体既保留其免疫活性，又保留酶活性,按一定步骤进行抗原抗体反应,加底物显色，依据颜色反应深浅进行定性或定量分析,抗体检测技术与类风湿因子,第8页,方法类型,ELISA,既可测抗原又可测抗体，依据试剂起源、标本性状以及检测详细条件，可设计出不一样类型检测方法：,1.,直接法,2.,间接法,3.,双抗体夹心法,4.,双夹心间接法,抗体检测技术与类风湿因子,第9页,抗体检测技术与类风湿因子,第10页,抗体检测技术与类风湿因子,第11页,抗体检测技术与类风湿因子,第12页,A sandwich ELISA,.(1)Plate is coated with a capture antibody;(2)sample is added,and any antigen present binds to capture antibody;(3)detecting antibody is added,and binds to antigen;(4)enzyme-linked secondary antibody is added,and binds to detecting antibody;(5)substrate is added,and is converted by enzyme to detectable form.,抗体检测技术与类风湿因子,第13页,一、试剂及仪器准备,（一）免疫吸附剂,1.,固相载体,要求：吸附力强,能保持,Ag,或,Ab,活性,不参加化学反应,抗体检测技术与类风湿因子,第14页,载体性能比较,要求,：,载体材料,+,、,-,结果差异大,检测方法,：,10ug/L IgG,包被,加酶标抗,IgG,，显色后，测,20,孔,OD,，要求,CV10%,常见载体：,材料,：,聚苯乙烯、聚乙烯、聚丙烯 等,形状,：,小试管、小珠、微量反应板,抗体检测技术与类风湿因子,第15页,2.Ag,或,Ab,：,纯度高、效价高、结协力高,3.,免疫吸附剂,(,固相,Ag,或,Ab),：,包被,：,将,Ag,或,Ab,固相化过程,包被缓冲液,封闭,：,包被后在用,1-5%,小牛血清白蛋白再包被，以消除非特异吸附干扰,抗体检测技术与类风湿因子,第16页,酶结合物：,1.,要求：,纯度高、催化转化率高、专一性强、性质稳定、起源丰富、标识后稳定,2.,常见酶,：,HRP,、,AP,、,-,半乳糖苷酶等,3.,底物：,HRP,可溶性底物及呈色：,邻苯二胺,(OPD),：橙红,(492nm),；四甲基联苯胺,(TMB),：蓝色,(450nm),5-,氨基水杨酸,(5-ASA),：棕色,(550nm),鲁咪诺,+H2O2,：荧光,HRP,不可溶性底物及呈色：,DAB,：棕黄色,-,萘酚：红色,3-,氧基,-9-,乙基卡唑：红色,4-,氯,-1-,萘酚：灰蓝色,AP,可溶性底物及呈色：,对硝基苯磷酸酯,(P-NPP),：黄色,(405nm)4-,甲基伞基磷酸酯,(4-MuP),：荧光,AP,不可溶性底物及呈色：,NBT,和,BCIP,混合液：紫色 坚固红和萘酚,ASMX,混合液：红色,-,半乳糖苷酶：,4-,甲基伞基,-,-,半乳糖苷：荧光,抗体检测技术与类风湿因子,第17页,4.,酶结合物制备：,戊二醛交联法,过碘酸盐氧化法,抗体检测技术与类风湿因子,第18页,（三）设备：,酶标比色仪,简称,酶标仪,指测读,ELISA,光度计；针对固相载体形式不一样，各有特制适合用于板、珠和小试管设计,性能指标,：测读速度、读数准确性、重复性、准确度和可测范围、线性,优良酶标仪读数普通可准确,0.001,，准确性为,1%,，重复性达,0.5%,操作,：室温宜在,15-30,，使用前先预热仪器,15-30min,，测读结果更稳定。

测读,A,值时，要选取产物敏感吸收峰，如,OPD,用,492nm,波长有酶标仪可用双波长式测读,抗体检测技术与类风湿因子,第19页,抗体检测技术与类风湿因子,第20页,用途,Dr Dennis E Bidwell and Alister Voller created the ELISA test to detect various kind of diseases,such as malaria,Chagas disease,and Johnes disease.ELISA tests also are used as in in vitro diagnostics in medical laboratories.The other uses of ELISA include:,detection of Mycobacterium antibodies in tuberculosis,detection of rotavirus in feces,detection of hepatitis B markers in serum,detection of enterotoxin of E.coli in feces,抗体检测技术与类风湿因子,第21页,WESTERN BLOT,步骤：,试剂准备：,1,、,SDS-PAGE,试剂,:,见电泳试验。

2,、匀浆缓冲液：,1.0M Tris-HCl(pH 6.8)1.Oml,；,10%SDS 6.0ml,；,-,巯基乙醇,0.2ml,；,ddH,2,O 2.8ml,3,、转膜缓冲液：甘氨酸,2.9g,；,Tris 5.8g,；,SDS 0.37g,；甲醇,200ml,；加,ddH,2,O,定容至,1000ml,4,、,0.01M PBS(pH7.4),：,NaCl 8.0g,；,KCl 0.2g,；,Na,2,HPO4 1.44g,；,KH,2,PO4 0.24g,；加,ddH,2,O,至,1000ml,5,、膜染色液：考马斯亮兰,0.2g,；甲醇,80ml,；乙酸,2ml,；,ddH,2,O118 ml,包被液（,5%,脱脂奶粉，现配）：脱脂奶粉,1.0g,溶于,20ml,0.01M PBS,中6,、显色液：,DAB 6.0mg,；,0.01M PBS 10.0ml,；硫酸镍胺,0.1ml,；,H,2,0,2,1.0,l,抗体检测技术与类风湿因子,第22页,样品制备,含量测定,抗体检测技术与类风湿因子,第23页,SDS,PAGE,电泳,抗体检测技术与类风湿因子,第24页,转膜,抗体检测技术与类风湿因子,第25页,免疫反应,抗体检测技术与类风湿因子,第26页,化学发光,抗体检测技术与类风湿因子,第27页,类风湿因子,类风湿因子（,rheumatoid factor,RF,）可分为,IgM,、,IgA,、,IgG,、,IgD,、,IgE,五型（注：在临床内科学中描述为四型，没有,IgD,型；但在试验室诊疗学中描述为,5,型），是类风湿关节炎血清中针对,IgG FC,片段上抗原表位一类本身抗体，类风湿因子阳性患者较多伴相关节外表现，如皮下结节及血管炎等。

抗体检测技术与类风湿因子,第28页,类风湿因子,约,90%,类风湿性关节炎（,RA,）患者,RF,呈阳性IgA-RF,与骨质破坏相关，早期,IgA-RF,升高常提醒病情严重，预后不良；,IgE-RF,升高时，已属病情晚期一些本身免疫病，如冷球蛋白血症、进行性全身性硬化症、干燥综合征、,SLE,等患者都有较高阳性率；一些其它疾病如血管炎、肝病、慢性感染也可出现,RF,抗体检测技术与类风湿因子,第29页,类风湿因子,多年来对,IgM,型类风湿因子生物作用已经有所了解，这些生物作用包含：,1,、调整体内免疫反应；,2,、激活补体，加紧去除微生物感染；,3,、去除免疫复合物使机体免受循环复合物损伤抗体检测技术与类风湿因子,第30页,类风湿因子,测定,IgG,、,IgA,、,IgM,类,RF,通常见,ELISA,间接法，即用热凝集兔,IgG,包被反应板微孔，加入检样后，再分别加抗人,IgG,、,IgA,、,IgM,酶标识抗体，使反应后再与底物呈色为预防各,Ig,类别,RF,相互干扰，酶标识抗体使用标识抗体,F,（,ab,）,2,片段抗体检测技术与类风湿因子,第31页,。