世界上最完善最详细地神经元原代培养完全黄金版资料
9页1、word世界上最完善最详细的神经元原代培养完全黄金版 精华序言:国内外关于原代培养有很多文献,不幸的是,没有一篇是详细的,没有一篇解答过why.为了让大家少走弯路,根据我杀过3000只老鼠的经验,我把我这几年摸索的经验和大家分享,请求多投几票得几个叮当。相信你follow我的这篇文章一定会做的很好。我的标题说的很像吹牛,但是我是严肃认真的说的,I earn it.note:这篇文章全是我个人的经验,99。9%原创,经过无数失败的到的最完美的原代神经元培养法,除了最后那一副图是来自下面第2行那篇文献,所以我才说是99.9%原创。注:附录的图是常用的消化酶对实验的存活率影响,来自下面里的文献另外,成年鼠的原代培养我没有摸索过,推荐一篇文献在我以前的帖子无需叮当:/ dxy/bbs/post/view?bid=156&id=17651341&sty=3 本篇专门讨论胎鼠和新生鼠神经元的原代培养。1.材料选择。一定要严格按照国际上,NCBI数据库,其他文献的材料一致。胎鼠就要胎鼠,新生鼠就要新生鼠,不能混淆。因为新生鼠有一些受体,在培养的工作中失去功能,会不能再生,比如NMDA受体。和文献不同
2、会导致错误结论,甚至困惑。很多人写信问我新生鼠的培养问题,我回答用新生鼠的实验很少,八成是你自己搞错了实验对象,请确认国际上的相关研究文献所用老鼠,再来问我下面的问题。2,培养基选择neurbasal/neurobasal-a,invitrogen Co.ltd)。我强烈不建议用血清培养。原因是:首先,血清刺激胶质细胞和杂细胞分裂,最后非常影响神经元产量;其次,为了抑制胶质生长,往往要参加阿糖孢苷。严重的毒性会影响许多灵敏实验;再次,最重要的,血清培养的细胞状态很不均一,从正常到凋亡都有,严重影响试验准确,而无血清专用培养基所有的正常细胞都处于一样的状态,要么都好,要么都差,高度一致。Invitrogen/GIBCO 无血清培养基neurobasal(neurbasal-A)被认为是最标准,最好的培养基。需要的添加剂为 B27和谷氨酰胺。培养出的细胞状态均一,胶质细胞几乎不分裂。其中,neurobasal是胎鼠培养基,而-A为新生鼠培养基。不过根据笔者实验,没什么太大区别,都能很轻松培养成功,但是,切忌中途换培养基,要从一而终。很多实验室是不加抗生素的,也有的实验室加。由于很多初学者操
3、作不熟练,不注意,很多人会污染,所以我还是建议加双抗。注意!由于无血清培养基添加剂不是血清,而是人工合成的B27也有用N2的,但是推荐B27,只差10美金,血清有复杂的解毒作用而B27没有,双抗对细胞的干扰,无血清培养基要大的多。所以,如果你在neurobasal里添加抗生素,记得用量只要标准量的一半。另一个添加成分谷氨酰胺溶液不稳定,所以每次用时候要现配现加冰上预冷。这就意味着,从你处死母鼠后,胎鼠的大脑的温度要最快的降低到0度。另外,在解剖过程中,胎鼠直到皮层或海马被剪碎的过程,有时候可能需要2小时,如果样品多。一定要注意多准备冰袋子。确保你的任何过程都在冰浴的培养液中进展消化步骤除外。这样可以大大提高存活率。在解剖大脑时候,有人用hanks,在其中解剖。根据我的经验,即使是0度,神经元还是在进展着很大程度代谢。所以,hanks的无糖环境很不利。我个人建议,用DMEM-高糖或DMEM-F12+马血清来浸泡解剖过程中的大脑,来供应大脑的代谢,血清可以抑制神经凋亡。这其中还有一个问题,就是DMEM培养液会在空气中变碱性。国外有的实验室用L-15培养液来浸泡解剖过程中的脑,因为L-15不
4、会再空气中变碱性。没有L-15的(国内几乎没有,可以全程用DMEM-HG或者DMEM-F12+血清浸泡解剖过程中的脑。注意注意:一切操作都在冰浴的液体中,所以要多准备冰袋。中途冰袋没了的是猪头4.关于培养皿的问题。一般来说,6孔板是最优选择。神经元让人苦恼的问题是,神经元发育的情况和密度相关。大于6孔板比如6CM DISH会使得中间很难和周围的细胞密度一样,造成板中间和边缘成熟度不一样,而这会给实验带来很大干扰。而太小的话96孔或128孔细胞会倾向于向中间集中也会照成发育不均匀。所以笔者经验是6孔板是最优选择。神经原代培养一定是要包被,用POLY-LYS或者胶原。关于POLY-LYS包被,我们是包被30分钟,吸干晾过夜,然后洗两次,或者只洗一次但是要30分钟接着晾干。由于neurobasal培养法相当成熟,所以没必要用难固定的胶原。5.处死母鼠并把胎鼠解剖时候,一定要注意母鼠状态,是否有死胎,胎儿胎盘是不是正常,有多少胎,母鼠是多少天的一般是E16-E18这些信息也要严格记录。处死孕鼠后,要立即取出子宫放入冰冷培养液中。注意孕鼠处死后要短暂的浸泡酒精消毒,防止污染。一般来说,冰袋笔者选
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