DNA的制备、操作步骤

1、、实验原理入噬菌体是最早使用的克隆载体，入噬菌体的基因组是一长度约为50kb的双链 DNA分子，它在宿主细胞有两种生活途径：其一是裂解生长，环状DNA分子在细 胞内多次复制，合成大量噬菌体基因产物，装配成噬菌体颗粒，裂解宿主菌再进 行下一次感染；其二是溶源性生长，即感染细胞内入噬菌体DNA整合到宿主菌 染色体 DNA 中与之一起复制，并遗传给子代细胞，宿主细胞不裂解。平板培养时， 裂解生长形成噬斑。液体培养时，裂解生长使菌液中宿主菌最后全部被裂解 而 释放出大量的噬菌体颗粒。经过改造的入噬菌体克隆位点可插入几到几十kb的外源DNA。许多cDNA和基 因组文库是以入噬菌体作为克隆载体构建的。因此，在经文库筛选得到目的克 隆后，我们常常需要利用入噬菌体裂解生长的特点，培养获得大量的噬菌体颗 粒，并提取入噬菌体DNA来开展进一步的工作。二、实验设备与试剂（一）实验试剂1. LB液体培养基：胰化蛋白胨（细菌培养用）10g,酵母提取物（细菌培养用） 5g，NaCl 10g,加ddHO至1000ml，完全溶解，分装小瓶，15lbf/in2高压灭菌220min。2. 1.5%琼脂LB固体培养基：称取

2、1.5g琼脂粉放入300ml锥形瓶，加lOOmlLB，15 lbf/in2高压灭菌20min，稍冷却，制备平皿。3. 20%麦芽糖：麦芽糖20g，加ddHO至100ml，0.22m滤膜过滤。24. SM 液：NaCl5.8g，MgSO 7HO2g，lMTrisCL（PH7.5） 50ml，2%明胶 5ml，42加 ddHO 至 1000ml。 15lbf/in2 高压灭菌 20min。25. RNase A 10mg/ml，TE配制，沸水浴15min，分装后贮存于-20C。6. DNase I 10mg/ml，TE 配制，分装后贮存于-20C。7. PEG 80008，10%SDS9, EDTA： 0.5MpH8.03,苯酚/氯仿/异戊醇（25： 24： 1）， 异丙醇，无水乙醇， 70%乙醇。（二）实验设备医疗器械采购网 1. 高压灭菌锅2. 培养皿3. 微量离心管4. 37C摇床5. 高速离心机6. 低温冰箱（三）实验材料入噬菌体原种三、实验步骤（一）入噬菌体平板培养1. 用SM液10倍梯度稀释入噬菌体原种。2. 取0.1ml各梯度稀释离心到一消毒微量离心管中，加0.2ml新鲜培养

3、的宿主 菌，加麦芽糖（0.2%）, MgSO （10mM）, 37C温育20min,使噬菌体颗粒吸附于细菌。43. 取熔化（4700.7%琼脂LB固体培养基3ml与上述管混匀，立即倒入预备（2-4 天）的含凝固1.5%琼脂LB固体培养基的平板内，轻轻晃动平板使均匀分布。4. 37C培养6-8hr后，观察噬斑形成。5. 用剪去部分头部的吸头挖取单个噬斑到0.5ml的SM液中，加0.05ml氯仿， 震荡37C温育10min。6. 重复-，获得单个噬斑滴度。（二）入噬菌体液体培养1. 取2ml新鲜培养的宿主菌，离心，0.4ml LB培养基重悬，加入噬菌体0.1ml （新鲜获得的单个噬斑，依滴度使之与宿主菌比约1/500-1000）。2. 加麦芽糖（0.2%）, MgSO （10mM），37C温育20min，使噬菌体颗粒吸附于4细菌。3. 加到100mlLB液体培养基中，加麦芽糖（0.2%），MgSO （10mM），37C摇震4培养9-12hr后可见裂解发生。4. 加0.1ml氯仿，37C继续摇震培养10-20min。（三）入噬菌体DNA提取1. 将上述裂解液转移至离心管，离心8000gX10min，去细菌碎片，取上清液。2. 加 RNase A、DNasel 至 1p g/ml, 37C温育 30min。3. 加9.3g PEG 8000, 5.8g NaCl,摇匀至溶解，冰浴1hr或4C过夜。4. 4C离心 10000gX20min,去上清液。5. 加2mlSM液，充分洗溶管壁及沉淀，移到新微量离心管，加20卩l 10%SDS, 20l 0.5M EDTA，68C15min。6. 加等体积苯酚/氯仿/异戊醇（25： 24： 1），混匀，离心12000gX5min，取 上层液到一新微量离心管，加等体积氯仿/异戊醇（24： 1） ，混匀，离心 12000gX5min。7. 取上层液到一新微量离心管，加等体积异丙醇，混匀，-20Clhr，4C离心 12000gX10min，去上清液。8. 1ml预冷的70%乙醇洗涤沉淀1-2次，4C离心8000gX7min，弃上清，将沉 淀室温下晾干。9. 沉淀溶于20l TE，-20C保存备用。

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