不同低温冷冻预处理对异体神经移植再生影响的实验研究

1、不同低温冷冻预处理对异体神经移植再生影响的实验研究【摘要】 目的 观察不同冷冻温度下保存的异体神经对周围神经缺损修复的效果。方法 取96只同种属雄性大鼠，其中24只为取材组，72只随机分为对照组（A、B组）和实验组（C、D、E、F组），每组12只。A组为新鲜自体神经移植组,B组为新鲜异体神经移植组,C、D、E和F组分别为经4、-50、-80和-196甘油保存3周的神经移植组。术后2周，进行免疫组织化学观察；术后9、16周进行大体观察、光镜检察、电生理测定。结果 术后2周， B组移植段见明显T淋巴细胞浸润，C、D、E组次之，A组及F组未见T淋巴细胞。术后9周及16周，从神经再生效果评价看：A组神经再生效果最好， F组次之，C、D、E组再次，B组最差。结论 在各冷冻组中，以 -196组神经再生效果最好，接近新鲜自体神经移植组。 【关键词】 低温 神经移植 周围神经 预处理 Abstract： Objective To investigate the regeneration of peripheral nerve allografts stored in the glycerol of d

2、ifferent temperature.Methods A total of 96 male Wistar rats,were randomly divided into 7 groups.Group A and B were the control groups,each of which included 12 rats;all underwent fresh femoral nerve autograft and allograft transplantation respectively.Twentyfour rats in group G were sacrificed to obtain 48 femoral nerves,which were randomly divided into 4 groups,12 nerves in each group,and were stored in glycerol for 3 weeks at 4, -50, -80 and -196 respectively.After storage for 3 weeks,412 nerv

3、es in each temperature group were randomly transplanted into 412 rats in target rats group C,D,E and F respectively.Two weeks after transplantation, two grafts of transplanted nerves in group AF were harvested randomly and examined with immunohistochemistry to observe the infiltration of lymphocyte to the grafts and regeneration of sciatic nerve and fiber.Nine and 16 weeks after transplantation,the regeneration of sciatic nerve was examined with histology,electrophysiology and with electron micr

4、oscope.Results Wallerian degeneration was observed in the proximal and distal ends of all grafts of nerves harvested at 2 weeks postengraftment; infiltration of T lymphocytes at the grafts in group B was significant,less T lymphocytes were seen in group C,D and E,while no T lymphocytes were seen in group A and F.Collagenoblast proliferation was observed in group B,Schwann cell proliferation in group A and F,while both collagenoblast and Schwann cell proliferation were observed in group C,D and E

5、.Nine and 16 weeks postengraftment,grafts in group B were severely adhered to the adjacent tissue,adherence in group A and F were slight,while that of groups C,D and E came between.Nerve regeneration of group A was the best,group F came second,the next were groups C,D and E,while group B was the worst.Conclusion The best storage temperature is -196. Key words：hypothermia;nerve allograft;peripheral nerve;pretreatment 周围神经缺损的修复，尤其是对长段神经干缺损的修复，其处理仍为临床上较棘手的问题。自体神经移植被公认为是修复神经缺损的最佳选择，但自体可供移植的神经来源有限、还会

6、给供区带来功能损害，临床应用受到一定的限制。如何找到一种或者几种合适方法的联用，有效降低移植神经的免疫原性、增加神经纤维的再生能力，将对临床上异体神经移植的常规开展起到积极的作用。目前效果较为肯定的预处理方法是低温冷冻，而保存在怎样的冷冻条件下效果最好，同样是我们所关注的。本研究的目的是用甘油做保存液，观察在不同冷冻温度下保存的异体神经对周围神经缺损修复的效果，以探求出最佳的冷冻温度。材料与方法1 动物与分组 健康同种属雄性Wistar大鼠96只，月龄2月以上，体重（30020）g。其中24只为取材组，72只随机分为对照组（A、B组）和实验组（C、D、E、F组），每组12只。A组为新鲜自体神经移植组,B组为新鲜异体神经移植组,C、D、E和F组分别为经4、-50、-80和-196甘油保存3周的神经移植组。2 主要仪器及试剂 显微手术器械，冰箱（容声，广东）,双目显微镜（奥林巴斯，日本）,病理组织包埋台（BMZ型，苏州）,超薄切片机（Rechert ltracut E型，德国）,电子显微镜（H-600，日本）,肌电检测仪（KEY point V 3.22，Medtronic，美国）,小鼠抗

7、大鼠CD4和CD8单克隆抗体(英国Serotec公司),兔抗人GAG单抗(美国SantaCruz公司) ,生物素标记的兔抗大鼠血清(美国Sigma公司) 。3 方法 3.5%水合氯醛1ml/100g腹腔麻醉。在大鼠股后外侧行纵行切口；从梨状肌孔下0.5cm处，用消毒剃刀片，切取神经干1.0cm。取材组：取24只大鼠双侧坐骨神经干取下1.5cm长，本实验4组(412)神经，置于37条件下，依次浸泡于50%、70%和85%的甘油中各3小时，再分装在盛有85%甘油EP管中密封，分别置于4、-50、-80冰箱与-196液氮瓶中（采用分阶段降温措施，降温速度11.5/min），保存时间均为3周。对照组A：将坐骨神经取下后立即移植给自体的对侧；对照组B：将坐骨神经取下后不作任何处理，立即相互交叉移植作为新鲜异体神经移植。实验组C、D、E、F组：分别在3周后在随机原则下将各组12条神经分别移植给12只大鼠。4 观察指标 大体观察；术后2周每组取2只大鼠做小鼠抗大鼠CD4和CD8单克隆抗体双标免疫组化；术后9周及16周，每组随机抽取5只，做以下检测指标：组织学切片光镜、神经电生理、透射电镜。5 统计学

8、分析 所有数据以均数标准差表示，用SPSS统计软件处理，采用q检验，P0.05视为无统计学差异。结果1 大体观察 术后2周，大鼠各实验足趾开始出现红肿，溃疡及糜烂；术后4周，大鼠实验趾脱落，其中足趾脱落情况以自体移植A组最轻，实验F组次之，B组最重；术后9周，A、F组溃疡已愈合，C、D、E组仍可见小溃疡且红肿明显，B组深大溃疡仍存在，肌肉萎缩明显；术后16周，A、F组已恢复近正常功能，C、D、E组无溃疡，已恢复部分后蹬动作，B组浅溃疡红肿存在，拖足行走。2 各组取材时移植体情况 术后2周取材见：A组近端肿胀，远端神经吻合口为少量结缔组织包裹，再植神经段色白，表面有少量毛细血管；其余各组移植体周围黏连明显，结缔组织包裹，再植神经段色白，表面未见毛细血管生长；B组黏连情况最重，F组情况略好，但仍重于A组。术后9周取材见：A组再植神经段近端肿胀轻，远端吻合口与周围组织黏连轻，再植神经段色白，表面有大量毛细血管，呈网状。F组情况与A组相近，B组再植神经段近远端吻合口与周围组织黏连重，再植神经段大部分为纤维组织包绕。其余各组情况介于F组与B组之间。术后16周取材见：A组与F组情况很相近：再植神经

9、段近端接近正常，远端吻合口与周围组织仅有少量细丝样黏连，再植神经段表面有大量毛细血管（图1）。B组情况最差，神经移植体部分为纤维组织替代，与周围组织黏连在一起，再植神经段无毛细血管生长。C、D、E组情况介于F组与B组之间。3 免疫组化观察 术后2周， CD4/CD8双标免疫组化结果：A组成纤维细胞较少，SC多，分布于变性神经纤维周围，排列规则，Wallerian变性明显，未见T淋巴细胞浸润；B组 Wallerian变性明显，成纤维细胞很多，SC较少（图2）每个视野均可见数个CD4/CD8T细胞亚群的浸润（棕色受染近圆形核）；C组成纤维细胞增生可见，SC增生可见，排列较规则，Wallerian变性可见，偶可见散在单个CD4/CD8T细胞亚群的浸润；D，E组结果基本同C组；F组成纤维细胞少，SC增生明显，排列规则，可见数个典型沿变性神经纤维周围分布的“圈”，Wallerian变性明显（图3），均未见T淋巴细胞浸润。4 光镜观察 术后9周，取各组大鼠5只在200倍视野下见：A组移植段血管增生，有髓神经纤维很多，SC增生很明显，排列较规则，轴索变性，髓鞘溶解可见，淋巴细胞浸润不明显；B组移植段有髓神经纤维少，SC可见，轴索变性，髓鞘溶解非常明显，见淋巴细胞浸润明显；C组移植近端，有髓神经纤维较少，SC增生较明显，轴索变性，髓鞘溶解明显，淋巴细胞浸润不明显；D和E组同C组相似；F组移植段近端，有髓神经纤维多，SC增生很明显，轴索变性，髓鞘溶解可见，淋巴细胞浸润不明显（图4）。5 电镜观察 神经移植术后9周，取各组大鼠2只，取移植体近端0.5cm送透射电镜检查，各组均见神经纤维再生：A组再生纤维数量多，髓鞘成熟，发育完善，髓鞘旁可见SC，轴浆均匀，丰富；B组再生纤维数极少，Wallweian变性严重，轴浆萎缩明显，几乎不能见；C组再生纤维数量较多，Wallerian变性可见，较广泛，轴浆萎缩较明显；D和

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