食品级酿酒酵母高效分泌展示表达系统构建
4页1、食品级酿酒酵母高效分泌/展示表达系统构建基因工程酵母菌在食品工业中的应用逐渐普遍,但重组菌抗生素抗性标记的 存在对食品安全具有潜在隐患。此外,较低的生产成本、简单方便的下游操作技 术和高水平的表达量等是工业大规模生产重组蛋白必须具备的特点。针对这些问题,本课题根据半乳糖-葡萄糖对GAL基因家族诱导-抑制效应以 及GAL4p对GAL基因的调控机制,采用同源重组技术分步敲除了工业多倍体酿酒 酵母MS-1染色体上的GAL1基因,并将GAL4基因整合到GALl基因位点,构建了不 同GAL基因型的重组酵母SG1、DG115.DPG65和GQ21。同时,选用a-半乳糖苷酶 作为食品级选择标记、B -1,3-1,4-葡聚糖酶作为报告基因构建了在GALl启动子 和MFa l信号肽控制指导下的食品级分泌表达载体YGMPA-PM :并以a-凝集素C- 端320个氨基酸为锚定序列,构建了能够展示表达p-1,3-1,4-葡聚糖酶的食品级 展示表达载体YGMPNA-PM.将构建的载体和不同GAL基因型的重组酵母相结合,得 到了适合工业化生产的食品级高效分泌表达系统和食品级高效展示表达系统。主要研究结果如下:扩增
2、了 GAL4结构基因全长序列,并构建了包含GAL4基 因+KanMX表达盒的模板质粒PMD18-TGK.通过同源重组以GAL4+KanMX表达盒替换 了工业三倍体酵母MS-1的三个等位的GALl基因中的一个,得到具有双GAL4的重 组酵母。以KanMX为敲除框架,敲除了 MS-l染色体上的一个GALl基因。利用LFH原理,设计了另外两套基因敲除框架KanMX+GALls和GALlt+KanMX, 依次敲除了双GAL4重组菌株染色体上剩余的两个GALl等位基因。考虑到重组菌 株应用的安全性,利用Cre/loxP系统切除了构建重组酿酒酵母菌株时使用的 KanMX抗性表达盒,并通过传代使Zeocin抗性质粒pSH47/ZEO丢失,得到不同GAL 基因型的重组酵母SGl、DG115.DPG65和GQ21。其中,重组菌株GQ21染色体上三个GALl基因全部缺失,且其中一个GALl基 因位点被整合了一个GAL4基因拷贝。对不同GAL基因型的重组酵母SG1、DG115、 DPG65和GQ21在含有不同碳源的培养基中的生长、发酵性能以及抗性和遗传稳 定性进行了测试。结果表明,重组酵母的GAL基因型在传
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