怎么样稀释一抗
4页1、怎么样稀释一抗我应使用浓度多高的一抗?对于我们注明“稀释度根据实验而定”的抗体,较难找到一个起始点。以下图表根据产品的纯度以及抗体将进行的应用提供了一些供使用的起始稀释度。未纯化的抗体在数据表中不会注明浓度。对于大多数全抗血清、培养物上清液或腹水产品,浓度尚未确定。未纯化的抗体制品在具体抗体浓度上差异很大。如果给定的未纯化抗体制品的具体抗体浓度未知,可以把下面的“浓度估值”区作为估算依据。请记住这些稀释度和浓度估值仅推荐用作起始点,有必要根据实验结果调整稀释度。组织培养上清液腹水全抗血清纯化抗体WB / 斑点杂交1/1001/10001/5001 ug/mlIHC / ICC纯的- 1/101/1001/50- 1/1005 ug/mlEIA / ELISA1/10001/100001/5000.1 ug/mlFACS / 流式细胞术1/1001/10001/5001 ug/mlIP1/1001/50-1/1001- 10 ug/ml浓度估值1- 3 mg/ml5- 10 mg/ml1- 10 mg/ml简单说几句,封闭血清的原理主要有两点,第一是待检样本会非特异性的和蛋白结合,从而导
2、致背景过高,因此可以用BSA或血清封闭掉这部分非特异性的结合,从这点看,BSA和血清没有明显区别。第二是待检样本中可能会有Fc受体,可以和抗体恒定区结合,与抗体特异性无关,封闭血清中有抗体,因此用血清可以封闭掉一抗及二抗和样本Fc受体之间结合。BSA则无法封闭Fc受体。不能用来自一抗同物种的血清举个例子就清楚了,比如一抗是鼠抗人的抗体,二抗是兔抗鼠的抗体,你要用鼠血清封闭的话,二抗就和封闭用的鼠血清里面的鼠抗体反应了,那不就假阳性了嘛。先加一抗后再封闭的话,一抗就会结合到固相表面上,这种结合力是非特异性的疏水作用力,这种作用力是比较强的,经过处理的固相表面如硝酸纤维膜,酶标板对蛋白的吸附力更强,你再去封闭就没有作用了。当然,也不是说封闭蛋白就完全不会封闭掉一抗的蛋白结合位点,在蛋白过量的条件下,蛋白质之间会有黏附和堆积作用,但这种作用通常是不稳定的。如果你所选择的一抗与固相抗原亲和力较高,在适合的buffer条件下,一抗会竞争它的结合位点。蛋白质之间那点黏附和堆积作用力当然竞争不过它啦。下面是从书上摘下的几句话,希望对你有帮助: 组织中非抗原抗体反应出现的阳性染色称为非特异性背景染色,
3、最常见的原因是蛋白吸附于高电荷的胶元和结缔组织成分上。最有效方法是在用第一抗体前加制备第 二抗体动物之非免疫血清(1:51:20) 封闭组织上带电荷基团而除去与第一抗体非特异性结合。必要时可加入 2%5% 牛血清蛋白,可进一步减少非特异性染色。作用时间为 1020min。 也可用除制备第一抗体以外的其它动物血清 (非免疫的)。有明显溶血的血清不能对消除背景的非特异性染色有很好的效果。当然使用特异性高、效价高的第一抗体是最重要的条件。抗原-抗体是免疫球蛋白分子上的抗原结合簇与抗原分子上的抗原决定簇相互吸引以及多种分子间的引力参与发生的。这种反应没有化学键的形成。抗原-抗体的结合是可逆的“DMEM:f12和BSA?可能BSA是用来包被的,如果只含有DMEM/F12和BSA肯定不能养出活细胞。你可以买Amresco或者Roche的BSA 组分v,95%纯度,冷醇法提取的。实际上FBS的主要成分就是BSA,只是还含有其它的一些生长因子和激素类的物质罢了。你用FBS即可。用多聚赖氨酸包被平皿同样也可以培养气管上皮。免疫组化封闭血清的选择和使用做免疫组化时,一般都会封闭。以减少假阳性。封闭主要是用
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