分析方法的选择

1、分析方法的选择 一般而言 ,体内样品中待测物的预期浓度范围是决定体内样品检测方法的首要因素。无论从 动物或人体内获得的体内样品,其中所含药物或其特定代谢产物的浓度大多较低 （1O-io-1O-6g/ml）.且难以通过增加体内样品量提高方法员敏度。因而在建立体内样品分析方法 时选择适宜的检测方法是必须首先考虑的。1. 色谱分析法 气相色谱、高效液相色谱等2. 免疫分析法放射免疫分析法（RIA）酶免疫分析法（EIA）荧光免疫分析法（FIA）,多用于蛋白质多肽等生物大分子的检测3. 生物学方法 常能反映药效学的本质，用于抗生素类亚欧我的体内分析4.由于色谱分析法具有较高的灵敏度、选择性、准确度和精密度被广泛使用分析方法建立的一般程序1）色谱条件的筛选2）色谱条件的优化3）试验样品的测试分析方法的验证（一）选择性1. 内源性物质的干扰2. 未知代谢产物的干扰3. 同服药物的干扰4. 与参比方法的相关性二)标准曲线与定量范围标准曲线反应了体内样品中所测定药物的浓度与仪器响应值的关系(三)定量下限定量下限(LLOQ)是标准曲线上的最低浓度点，表示方法的灵敏度即测定样品中符 合准确度和精密度要求的最

2、低药物浓度。(四)精密度与准确度精密度(precisio n)是指在确定的分析条件下相同生物基质中相同浓度样品的一系 列测量值的分散程度。通常用QC样品的相对标准差(RSD)表示。MM-SAKUftxy= M 1QQ% 阳；= 3009!；准确度(acecuraey)是指在确定的分析条件下测得的试验样品浓度与真实浓度的 接近程度，通常用QC样品的实测浓度与标示浓度的百分比(accuracy)或相对偏差 (relative rror,RE)表示。准确度可通过重复测定已知浓度的待测物样品获得。x|(W=工工g-讦-工淀-订t=) J=1E-|J A-l 批为r嗣=工-五)样品稳定性在体内药物分析中。含药体内样品由临床实验室(或动物实验室)采集后转移 至分析实验室进行分析测试 ,通常不能及时完成分析;另-方面,体内样品的数量- 般较大,在1个工作日内难以完成全部体内样品的分析,通常需在多个工作日内完 成;其次，随着自动进样器的应用,多个处理过的样品同时置于自动进样器中等待 分析;再者,每个未知体内样品一般测定 1次，但有时亦需进行复测。此外分析物 和内标物储备液和工作溶液在整个分析过程中的稳

3、定性也很重要。为确保分析结 果的可靠性与可重复性,必须在分析方法的每一步骤确保样品的稳定性。对分析物和内标的储备液和工作溶液以及QC样品的稳定性考察应在不同储 存条件下进行,时间尺度应考虑试验样品储存的时间1. 短期稳定性 通常应考察分析物和内标的储备液和工作溶液及 QC 样品 从冰箱储存条件到室温或样品处理温度下短期放置的稳定性、QC样品的冷冻和 融化稳定性,以及处理过的样品在自动进样器温度下的稳定性，以保证检测结果 的准确性和重现性。2. 长期稳定性 在整个样品分析期间,QC样品的长期储存.以及分析物和 内标的储备液和工作溶液的长期储存稳定性也将影响着分析结果的准确性和重 现性。所以，需对QC样品在冰冻（-20C或-80C）条件下、分析物和内标的储备液和 工作溶液在特定温度（如4C或-20C）下以及不同存放时间进行稳定性评价，以确定 QC样品和分析物和内标的储备液和工作溶液稳定的存放条件和时间，应在确保样 品稳定的条件下进行测定。3 .测定方法（1）测定法与要求:采用低和高浓度 QC 样品,进行室温或样品处理温度下的短期 放置稳定性.冷冻和融化稳定性、冰箱长期储存的长期稳定性以及处

4、理过的样品 在自动进样器温度下的稳定性考察。由新鲜配制的校正标样获得标准曲线,根据 标准曲线分析质控样品，每个浓度至少用5个QC样品，将测得浓度与标示浓度比 较,每一浓度的均值与标示浓度的偏差应在+15%范圈内。对分析物和内标的储备 液和工作溶液的进行短期稳定性考察时.通常是比较不同储存条件下纯溶液样品 之间测得浓度均值的差异,如室温放置和4C条件下储存;对纯溶液进行长期稳定 性考察时通常是比较新鲜配制和长期储存（如-80C储存90天）的纯溶液样品之 间测得浓度均值的差异。其差异应满足方法学要求。（2）稳定性期限要求:在不同的存放条件下存放时间要求不同。如在室温下一般 仅需考察1个工作日（如 1.2.4.8或24小时）的稳定性即可;在冰箱中（一4 C或 -20 C或-80 C ）则应考察数个工作日（或数星期，甚至数月）内的稳定性。例 如,QC样品室温放置待处理，应不超过1个工作日；处理过的样品在自动进样器 温度下待测定，应不超过3个工作8;QC样品应于冰箱内冷冻（-20C或-80C）储存 至整个分析完成（可能需数星期甚至数月）;分析物和内标储备液和工作溶液亦应 于冰箱内（4C或-20C

5、）储存至整个分析完成。若在此期间不够稳定。则应考察分 析物对照标准物质粉末的稳定性;血浆冻-融至少经历3个循环，首次冷冻时间应 在 24 小时以上。（六）提取回收率提取回收率 系指从生物样本基质中回收得到待测物的响应值与加人QC样品浓 度的含待测物的纯溶液至提取后的空白基质样品中产生的响应值的比值，通常 以%表示。待测物的提取回收宰用于评价样品处理方法将体内样品中待测物从生 物基质中提取出来的能力。在体内药物分析中，因为体内样品的量较少。待测药 物的浓度通常较低,不宜进行多步骤操作;且体内样品数量大,要求样品处理方法 尽量简便、快速。所以.对于样品处理方法的评价重点在于结果的精密与重现,而 非待测物提取的完全与否。R= xlOO%计算公式（七）基质效应当采用质谱为检测器的LC-MS或LC-MS/MS技术进行样品分析检测时，由于待测物的离子化效率（电喷雾电离,ESI）易受样品中的基质成分的影响,应该考察基质效应（matix feet1. 测定法使用至少 6 批来自不同供体的空白基质，不应使用合并的基质。 如果基质难以获得，则使用少于6 批基质,但应该说明理由。对于每批基质,应该 通过计算

6、基质存在下的峰面积（由空白基质提取后加人分析物和内标测得）。与不 含基质的相应峰面积（分析物和内标的纯溶液）比值,计算每一分析物和内标的基 质因子（matrix factor）%进一步通过分析物的基质因子除以内标的基质因子.计算 经内标归-一化的基质因子。2. 限度要求从6批基质计算的内标归一化的基质因子的变异系数不得大于 15%。该测定应分别在低浓度和高浓度下进行。除正常基质外,还应关注其他样品的基质效应,例如溶血的或高脂血症的血 浆样品等。（八）试验样品分析九）试验样品浓度超出定量范围的处理标准曲线的范围不能外延.在试验样品分析过程中，对于任何浓度高于UL0Q或低 于UL0Q的样品应进行处理后再进行测定。1. 浓度高于UL0Q应分取部分样品用相应的空白生物基质稀释-定倍数后重 新测定并同时制备浓度高于UL0Q的QC样品，同法稀释测定（并确保稀释后浓度 不低于LL0Q）,每个稀释因子或倍数至少5个测定值，以确认稀释的可靠性。准 确度和精密度应在+15%范围内，稀释的可靠性应该覆盖试验样品所用的稀释倍 数。2. 浓度低于LL0Q对于浓度低于LL0Q的样品。在必要时，可通过改变分析方法的

7、 定量范围，降低LL0Q的浓度，进行部分验证,从而获得其浓度值。药代动力学分析时低于LL0Q的样品，在C.以前出现应以零值计，在C. 以后出现应记为无法定量（not de table, ND）,以减小零值对AUC计算的影响。（十）作为外源性药物使用的内源性物质的测定由于生物基质中存在内源性的该物质,使得难以测定分析方法的 LLOQ 和 准确度。此时，可通过以下方法制备空白生物基质:1. 对生物基质进行处理将生物基质通过活性炭滤过透析等技术去除所含的该内 源性物质后,作为空白生物基质使用。2. 使用不含内源性物质的生物基质对生物参数随周期性变化的内源性物质 （如雄 性激素）,可在特定的生物周期阶段获取不含该物质的生物基质作为空白生物基 质。3. 使用替代基质对某些内 源性物质可使用其他基质替代空白生物基质 ,如兔血 浆、人血清蛋白、缓冲液0.9%氯化钠溶液等。测得的药物浓度需进行校正。即,C=C C ,C 通过由替代基质获得的标准曲线计算求得。真实 测得 本底 本底4. 采用标准加入法内源性物 质含量较低时,可使用混合生物基质 ,采用标 准加入法,测定本底浓度,并在此基础上,再配制系列校正标样样品,并用于试验样 品测定。结果为总量浓度。（十一）微生物和免疫学方法的测定上述分析方法验证主要针对色谱分析法。多数参数和原则也适用于微生物学 或免疫学分析法,但在方法验证中应考虑到它们的- o 些特殊之处。微生物学或免 疫学分析法的标准曲线本质上是非线性的,应尽可能采用比色谱分析法更多的浓 度点来建立标准曲线。结果的准确度是关键因素,如果重复测定能够改善准确度, 则应在方法验证和试验样品测定中采用同样的步骤。微生物学或免疫学分析方法验证实验应包括在数天内进行至少 6 个独立的 分析批测定。每个分析批应包括至少3套质控样品且每套含至少5个浓度（LLOQ、 低、中、高浓度及定量上限浓度）的质控样品。对于批内和批间准确度,各浓度质 控样品的平均浓度应在标示值的+20%范围内（定量下限和定量上限为+25%。各浓 度质控样品的批内和批间精密度均不应超过20%（定量下限和定量上限为 25%）。 此外。各浓度质控样品的方法总误差（即%相对偏差绝对值与%变异系数之和）不应 超过30% （定量下限和定量上限为 40%）。

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