精液的冷冻保存.docx

精液的保存（一）精液冷冻保存的概念：将采集到的新鲜精液，经过特殊处理后，主要利用液态氮 （-196°C）或干冰（-79 °C）作为冷源以冻结的形式保存于超低 温环境下，进行长期保存二）精液冷冻保存原理1•冷冻保存的温度为-196 C （液氮）和-79C（干冰）的超低 温，超低温条件下精子代谢处于静止状态2.在抗冻保护剂作用下，采用一定降温速率，尽量形成玻璃化 防止冰晶化 1）晶体化 （ 0--60C；-15-- -25 C 最多）a 物理伤害：精子水分形成冰晶，体积增大形状不规则，扩展和移动，造成精子膜和细胞内部结构的机械损伤b化学伤害：精子内水分在形成冰晶过程中引起溶液不同部分渗透压变高，造成精子脱水2)玻璃化 ( -60--250 C)玻璃化中水分子保持原来无序状态，形成纯粹玻璃样的超微粒 结晶精子不会发生细胞脱水，结构维持正常，解冻后可以复苏3、抗冻剂作用1）防止冰晶形成，增加精子抗冻力2）抗冻物质：二甲基亚砜（ DMSO）、 甘油、乙二醇例如：甘油可以与水分子通过氢键结合，阻止水分子形成冰晶， 降低水形成冰晶的温度，缩小危险温度区但是浓度过高，对精子 有毒害作用三）精液冷冻保存稀释液1．牛冷冻保存稀释液 主要有乳糖—卵黄—甘油液；蔗糖— 卵黄—甘油液 ；葡萄糖—卵黄—甘油液和葡萄糖—柠檬酸钠— 卵黄一甘油液等四种，甘油的浓度以5〜7%。

常用稀释液列表6—82.猪冷冻保存稀释液般采用以葡萄糖、乳糖、蔗糖、甘油为主要成分的稀释液甘油浓度以 1%〜3%为宜常用稀释液列于表 6〜9、103.马、绵羊冷冻稀释液 一般采用糖类（葡萄糖、果糖、乳糖、 棉子糖、蔗糖）乳类、卵黄、甘油为主要成分，甘油的浓度以 3.5〜5%常用稀释液列于表 6〜9、10四）冷冻保存技术程序1、精液的稀释一步稀释法应用：颗粒和细管冷冻精液方法：含甘油抗冻剂的稀释液一次按稀释比例同温稀释 特点：二步稀释法 应用：细管冷冻精液方法：稀释一半(无甘油)-1—1.5h缓慢降温(30 °C ~ 5 °C ) 等温稀释(甘油1—1.5h缓慢降温(30 C ~ 5 C )2、精液的平衡和分装颗粒法：将平衡的精液直接滴冻成0.1〜0・2ml颗粒细管法：牛冷冻精液多用0.25或0.5ml塑料细管，在5°C下用 精液分装机分装，用封口粉、塑料球或超声波封口，平衡后冻结安瓿法：将处理好稀释精液分装在安瓿中3、精液的冷冻(颗粒精液冷冻法)1)预冷：铜纱网或铝饭盒盖或氟板等器具预冷后保持与液氮面2cm,温度-80〜-120 C(2) 滴冻：将平衡后的精液定量而均匀的滴冻(滴管需预冷与 平衡温度一致)，每粒0・1ml。

3) 液氮冷冻：将颗粒停留2-4min，当颜色变白时，将颗粒 置入液氮中 2min(4) 活力检查：取出 1〜2 粒解冻，检查精子活率( 5)液氮保存：活率达 0.3 以上收集到纱布袋中，作好标记 贮存于液氮罐中保存细管精液冷冻法与颗粒熏蒸法基本相同，将冷冻样品平放在距液氮面 2-2.5cm的铜纱网上，冷冻温度为-80〜-120 C,停留5〜7min。