蛋白质提取与制备.docx

蛋白质提取与制备的原理和方法蛋白质提取与制备蛋白质种类很多，性质上的差异很大，既或是同类蛋白质，因选用材料不同，使用方 法差别也很大，且又处于不同的体系中，因此不可能有一个固定的程序适用各类蛋白质的分离但多数分 离工作中的关键部分基本手段还是共同的，大部分蛋白质均可溶于水、稀盐、稀酸或稀碱溶液中，少数与 脂类结合的蛋白质溶于乙醇、丙酮及丁醇等有机溶剂中因此可采用不同溶剂提取、分离及纯化蛋白质和 酶 蛋白质与酶在不同溶剂中溶解度的差异，主要取决于蛋白分子中非极性疏水基团与极性亲水基团的 比例，其次取决于这些基团的排列和偶极矩故分子结构性质是不同蛋白质溶解差异的内因温度、pH、 离子强度等是影响蛋白质溶解度的外界条件提取蛋白质时常根据这些内外因素综合加以利用将细胞内 蛋白质提取出来并与其它不需要的物质分开但动物材料中的蛋白质有些可溶性的形式存在于体液（如 血浆、消化硫等）中，可以不必经过提取直接进行分离蛋白质中的角蛋白、胶原及丝蛋白等不溶性蛋白 质，只需要适当的溶剂洗去可溶性的伴随物，如脂类、糖类以及其他可溶性蛋白质，最后剩下的就是不溶 性蛋白质这些蛋白质经细胞破碎后，用水、稀盐酸及缓冲液等适当溶剂，将蛋白质溶解出来，再用离心 法除去不溶物，即得粗提取液。

水适用于白蛋白类蛋白质的抽提如果抽提物的pH用适当缓冲液控制时， 共稳定性及溶解度均能增加如球蛋白类能溶于稀盐溶液中，脂蛋白可用稀的去垢剂溶液如十二烷基硫酸 钠、洋地黄皂苷（Digitonin ）溶液或有机溶剂来抽提其它不溶于水的蛋白质通常用稀碱溶液抽提蛋白质类别和溶解性质白蛋白 和球蛋白: 溶于水及稀盐、稀酸、稀碱溶液，可被 50%饱和度硫酸铵析出真球蛋白 : 一般在等电点时不溶于水，但加入少量的盐、酸、碱则可溶解拟球蛋白: 溶于水，可为 50%饱和度硫酸铵析出醇溶蛋白： 溶于70〜80%乙醇中，不溶于水及无水乙醇壳蛋白: 在等电点不溶于水，也不溶于稀盐酸，易溶于稀酸、稀碱溶液精蛋白： 溶于水和稀酸，易在稀氨水中沉淀组蛋白： 溶于水和稀酸，易在稀氨水中沉淀硬蛋白质： 不溶于水、盐、稀酸及稀碱缀合蛋白（包括磷蛋白、粘蛋白、糖蛋白、核蛋白、脂蛋白、血红蛋白、金属蛋白、黄素蛋白和氮苯蛋白等） ： 此 类蛋白质溶解性质随蛋白质与非蛋白质结合部分的不同而异，除脂蛋白外，一般可溶于稀酸、稀碱及盐溶 液中，脂蛋白如脂肪部分露于外，则脂溶性占优势，如脂肪部分被包围于分子之中，则水溶性占优势蛋 白质的制备是一项十分细致的工作。

涉及物理学、化学和生物学的知识很广近年来虽然有了不改进，但 其主要原理仍不外乎两个方面：一是利用混合物中几个组分分配率的差别，把它们分配于可用机械方法分 离的两个或几个物相中，如盐析、有机溶剂提取、层析和结晶等；二是将混合物置于单一物相中，通过物 理力场的作用使各组分分配于不同区域而达到分离的目的，如电泳、超离心、超滤等由于蛋白质不能溶 化，也不能蒸发，所能分配的物相只限于固相和液相，并在这两相间互相交替进行分离纯化制备方法可 按照分子大小、形状、带电性质及溶解度等主要因素进行分类按分子大小和形态分为差速离心、超滤、 分子筛及透析等方法；按溶解度分为盐析、溶剂抽提、分配层析、逆流分配及结晶等方法；按电荷差异分 为电泳、电渗析、等电点沉淀、离子交换层析及吸附层析等；按生物功能专一性有亲合层析法等由于不同生物大分子结构及理化性质不同，分离方法也不一样即同一类生物大分子由于选用材料不同， 使用方法差别也很大因此很难有一个统一标准的方法对任何蛋白质均可循用因此实验前应进行充分调 查研究，查阅有关文献资料，对欲分离提纯物质的物理、化学及生物学性质先有一定了解，然后再着手进 行实验工作对于一个未知结构及性质的试样进行创造性的分离提纯时，更需要经过各种方法比较和摸索， 才能找到一些工作规律和获得预期结果。

其次在分离提纯工作前，常须建立相应的分析鉴定方法，以正确 指导整个分离纯化工作的顺利进行高度提纯某一生物大分子，一般要经过多种方法、步骤及不断变换各 种外界条件才能达到目的因此，整个实验过程方法的优劣，选择条件效果的好坏，均须通过分析鉴定来 判明另一方面，蛋白质常以与其他生物体物质结合形式存在，因此也易与这些物质结合，这给分离精制带来 了困难如极微量的金属和糖对巨大蛋白质的稳定性起决定作用，若被除去则不稳定的蛋白质结晶化的难 度也随之增加如高峰淀粉酶A的Ca2+,胰岛素Zn2+等此外，高分子蛋白质具有一定的立体构象，相 当不稳定，如前所述极易变性、变构，因此限制了分离精制的方法通常是根据具体对象联用各种方法 为得到天然状态的蛋白质，尽量采用温和的手段，如中性、低温、避免起泡等，并还要注意防腐注意共存成分的影响如蝮蛇粗毒的蛋白质水解酶活性很高，在分离纯化中需引起重视纯化蝮蛇神经 毒素时，当室温超过20°C时，几乎得不到神经毒素蝮蛇毒中的蛋白水解酶能被0.1mol/L EDTA完全抑制， 因此在进行柱层析前先将粗毒素0.1mol/LEDTA溶液处理，即使在室温高于20C，仍能很好的得到神经毒 素。

整个制备过程一般可分为5个阶段：①材料的选择和预处理 ②细胞的破碎（有时需进行细胞器的分离） ③提取④纯化（包括盐析，有机溶剂沉淀，有机溶剂提取、吸附、层析、超离心及结晶等）⑤浓缩、干 燥及保存以上 5 个阶段不是要求每个方案都完整地具备，也不是每一阶段截然分开不论是哪一阶段使 用哪一种方法，均必须在操作中保存生物大分子结构的完整性保存活性防止变性及降解现象的发生因 空间结构主要依靠氢键、盐键和范德华力的存在，遇酸、遇碱、高温、剧烈的机械作用及强烈的辐射等均 可导致活性丧失因此选择的条件应为十分温和同时应注意防止系统中重金属离子、细胞自身酶系及其 他有毒物质的污染蛋白质提取与制备的注意事宜:一、 原料的选择早年为了研究的方便，尽量寻找含某种蛋白质丰富的器官从中提取蛋白质但至目前经常遇到的多是含 量低的器官或组织且量也很小，如下丘脑、松果体、细胞膜或内膜等原材料，因而对提取要求更复杂一些原料的选择主要依据实验目的定从工业生产角度考虑，注意选含量高、来源丰富及成本低的原料尽 量要新鲜原料但有时这几方面不同时具备含量丰富但来源困难，或含量来源均理想，但分离纯化操作 繁琐，反而不如含量略低些易于获得纯品者。

一般要注意种属的关系，如鲣的心肌细胞色素C较马的易结 晶，马的血红蛋白较牛的易结晶要事前调查制备的难易情况若利用蛋白质的活性，对原料的种属应几 乎无影响如利用胰蛋白酶水解蛋白质的活性，用猪或牛胰脏均可但若研究蛋白质自身的性质及结构时， 原料的来源种属必须一定研究由于病态引起的特殊蛋白质（本斯.琼斯氏蛋白、贫血血红蛋白）时，不但 使用种属一定的原料，而且要取自同一个体的原料可能时尽量用全年均可采到的原料对动物生理状态 间的差异（如饥饿时脂肪和糖类相对减少），采收期及产地等因素也要注意二、 前处理1、细胞的破碎材料选定通常要进行处理要剔除结缔组织及脂肪组织如不能立即进行实验，则应冷冻保存除了提 取及胞细外成分，对细胞内及多细胞生物组织中的蛋白质的分离提取均须先将细胞破碎，使其充分释放到 溶液中不同生物体或同一生物体不同的组织，其细胞破坏难易不一，使用方法也不完全相同如动物胰 肝、脑组织一般较柔软，作普通匀浆器磨研即可，肌肉及心组织较韧，需预先绞碎再制成匀桨⑴机械方法主要通过机械切力的作用使组织细胞破坏常用器械有：①高速组织捣碎机（转速可达10000rpm，具高 速转动的锋利的刀片），宜用于动物内脏组织的破碎；②玻璃匀浆器（用两个磨砂面相互摩擦，将细胞磨碎）， 适用于少量材料，也可用不锈钢或硬质塑料等，两面间隔只有十分之几毫米，对细胞破碎程度较高速捣碎 机高，机械切力对分子破坏较小。

小量的也可用乳钵与适当的缓冲剂磨碎提取，也可加氧化铝、石英砂及 玻璃粉磨细但在磨细时局部往往生热导致变性或 pH 显著变化，尤其用玻璃粉和氧化铝时磨细剂的吸 附也可导致损失⑵物理方法主要通过各种物理因素的作用，使组织细胞破碎的方法I反复冻融法于冷藏库或干冰反复于零下15〜20C使之冻固，然后缓慢地融解，如此反复操作，使大部分细胞及细胞 内颗粒破坏由于渗透压的变化，使结合水冻结产生组织的变性，冰片将细胞膜破碎，使蛋白质可溶化， 成为粘稠的浓溶液，但脂蛋白冻结变性II冷热变替法将材料投入沸水中，于90°C左右维持数分钟，立即置于冰浴中使之迅速冷却，绝大部分细胞被破坏III超声波法暴露于9~10千周声波或10~500千周超声波所产生的机械振动，只要有设备该法方便且效果也好，但 一次处理量较小应用超声波处理时应注意避免溶液中气泡的存在处理一些超声波敏感的蛋白质酶时宜 慎重IV加压破碎法加一定气压或水压也可使细胞破碎⑶化学及生物化学方法I有机溶媒法粉碎后的新鲜材料在0C以下加入5~10倍量的丙酮，迅速搅拌均匀，可破碎细胞膜，破坏蛋白质与脂 质的结合蛋白质一般不变性，被脱脂和脱水成为干燥粉末用少量乙醚洗，经滤纸干燥，如脱氢酶等可 保存数月不失去活性。

II自溶法将待破碎的鲜材料在一定pH和适当的温度下，利用自身的蛋白酶将细胞破坏，使细胞内含物释放出来 比较稳定，变性较难，蛋白质不被分解而可溶化利用该法可从胰脏制取羧肽酶自体融解时需要时间， 需加少量甲苯、氯仿等应防止细菌污染于温室30C左右较早溶化自体融解过程中PH显著变化，随 时要调节pH自溶温度选在0〜4C，因自溶时间较长，不易控制，所以制备活性蛋白质时较少用III酶法与前述的自体融法同理，用胰蛋白酶等蛋白酶除去变性蛋白质但值得提出的是溶菌酶处理时，它能水 解构成枯草菌等菌体膜的多糖类能溶解菌的酶分布很广尤其卵白中含量高，而多易结晶化1g菌体加 1〜10mg溶菌酶，pH6.2~7.01h内完全溶菌于生理食盐水或0.2mol蔗糖溶液中溶菌，虽失去细胞膜， 但原形质没有脱出除溶菌酶外，蜗牛酶及纤维素酶也常被选为破坏细菌及植物细胞用表面活性剂处理较常用的有十二烷基磺酸钠、氯化十二烷基吡淀及去氧胆酸钠等此外一些细胞膜较脆弱的细胞，可把它们置于水或低渗缓冲剂中透析将细胞胀破2、细胞器的分离制备某一种生物大分子需要采用细胞中某一部分的材料，或者为了纯化某一特定细胞器上的生物大分子， 防止其他细胞组分的干扰，细胞破碎后常将细胞内各组分先行分离，对于制备一些难度较大需求纯度较高 的生物大分子是有利的。

尤其近年来分子生物学、分子遗传学、遗传工程等学科和技术的发展，对分布在 各种细胞器上的核酸和蛋白质的研究工作日益增多，分离各种细胞器上的各类核酸和特异性蛋白质已成为 生物大分子制备工作重要内容之一各类生物大分子在细胞内的分布是不同的DNA几乎全部集中在细胞 核内RNA则大部分分布于细胞质各种酶在细胞内分布也有一定位置因此制备细胞器上的生物大分子 时，预先须对整个细胞结构和各类生物大分子在细胞内分布匹有所了解以肝细胞为例,蛋白质、酶及核酸 在肝细胞内分布情况为:细胞核：精蛋白、组蛋白、核酸合成酶系RNA占总量10%左右DNA几乎全部粒线体: 电子传递、氯化磷酸化、三羧酸循环、脂肪酸氧化、氨基酸氧化、脲合成等酶 系 RNA 占总量 5%左右 DNA微量内质网（微粒体）：蛋白质合成酶系、羟化酶系RNA占总量50%左右溶酶体 ： 水解酶系（包括核酸酶、磷酸脂酶、组织蛋白酶及糖苷及糖苷酶等）高尔基氏体： 糖苷转移酶、粘多糖及类固醇合成酶系细胞膜：载体与受体蛋白、特异抗蛋、ATP酶、环化腺苷酶、5、核苷酸酶、琥珀酸脱氢酶、葡萄糖-6-磷 酸酶等，细胞液嘧啶和嘌吟代谢、氨基酸合成酶系、可溶性蛋白类RNA 。