《生物制药工艺技术》教学课件05-基因工程制药技术.pptx

知识目标】 了解基因工程药物的发展情况知晓基因工程药物的设计原理熟知基因工程药物常用的生产方法熟知基因工程菌的培养、发酵、分离和提纯过程，并能用基因工程原理解释操作中出现的现象 【技能目标】 能对基因工程菌进行发酵生产，并能对发酵过程的控制指标和发酵终点进行准确判断1953年，沃森（Watson）和克里克（Crick）提出了DNA双螺旋理论，为基因工程技术奠定了理论基础1982年，美国首先将重组胰岛素投放市场，标志着世界第一个基因工程药物的诞生1989年，我国第一个基因工程药物-重人干扰素批准上市1992年第一个基因工程乙肝疫苗投入市场基因工程药物有多肽、蛋白质、酶类（尿激酶、链激酶、超氧化物歧化酶）、激素、疫苗、单克隆抗和细胞因子（干扰素、白介素、生长因子）等 基因工程又称基因拼接技术或DNA重组技术，是指将不同来源的DNA片段（目的基因）按预先设计的蓝图，插入到质粒、病毒等载体中，实现遗传物质的重新组合，然后导入宿主细胞，并在其中扩增和表达的过程 基因工程药物是首先确定对某种疾病有预防和治疗作用的蛋白质，然后将控制该蛋白质合成过程的DNA片段（目的基因）取出来，经过一系列基因操作，最后将该DNA片段放入可以大量生产的宿主细胞中去，在宿主细胞不断繁殖过程中，大规模生产具有预防和治疗这些疾病的药用蛋白质。

获得目的基因获得目的基因组建重组质粒组建重组质粒构建基因工程菌构建基因工程菌培培 养养 工工 程程 菌菌除除 菌菌 过过 滤滤产物分离纯化产物分离纯化半半 成成 品品 检检 定定成成 品品 检检 定定包包 装装基因工程的基本特点是，分子水平操作，细胞水平表达基因工程的基本特点是，分子水平操作，细胞水平表达在这个过程中：在这个过程中： 1.“1.“基因剪刀基因剪刀” ” 剪取剪取DNADNA的酶就像一把的酶就像一把“基因剪刀基因剪刀2.“2.“缝纫针缝纫针” ” 连连接接不不同同来来源源DNADNA分分子子的的酶酶就就像像一一根根“缝缝纫纫针针”，使使二者连在一起二者连在一起3.“3.“交通工具交通工具” 使用载体好比一辆车子使用载体好比一辆车子4.“4.“乘客乘客” 有有用用基基因因如如ILIL2 2好好比比使使乘乘客客，车车子子把把乘乘客客送送进进理理想想天天堂堂（宿宿主主细细胞胞）去去繁繁衍衍生生息息，春春华华秋秋实实，生生产产我我们们需需要要的产品或开展基因治疗（的产品或开展基因治疗（ILIL2 2/LAK/LAK抗癌）基基因因工工程程药药物物生生产产示示意意图图一、基因操作中常用的工具酶 由于DNA分子很小，其直径只有2nm，DNA分子的重组就如同在它们身上进行“手术”，这种操作是非常困难的，因此基因工程实际上是一种“超级显微工程”，是分子水平上的操作，为了获得需要重组和能够重组的DNA片段，需要一系列酶促反应的参与，对DNA的修饰、切割、缝合，这些酶包括：限制性核酸内切酶、连接酶、聚合酶等对基因进行人工切割和拼接等操作，将这些酶称为工具酶。

一）限制性内切酶 限制性内切酶，是一类能够识别双链DNA分子上特定核苷酸序列，并对此进行切割的水解酶主要存在于原核微生物中根据限制酶的结构，辅因子的需求切位与作用方式，分为型、型、型 型限制性内切酶能识别双链DNA分子中46bp组成的特定核苷酸序列称为识别序列或识别位点，并对双链DNA进行切割，产生特定的酶切末端第一个字母取自产生该酶的细菌属名，用大写；第二、第三个字母是该细菌的种名，用小写；第四个字母代表株；用罗马数字表示发现的先后次序命名：命名：Hin d 属属 系系 株株 序序Haemophilus influenzae d株流感嗜血杆菌d株的第三种酶（二）DNA连接酶 DNA连接酶是能够催化两条分别具有5-磷酰基末端与3-羟基末端的DNA单链之间形成磷酸二酯键，从而将两条DNA分子拼接起来目前广泛使用的连接酶有T4噬菌体DNA连接酶和大肠杆菌DNA连接酶三）聚合酶 1957年，美国科学家Arthur Kornberg首次在大肠杆菌中发现DNA聚合酶，这种酶被称为DNA聚合酶I（DNA polymerase I，简称：Pol I） 聚合酶分为RNA聚合酶和DNA聚合酶，分别催化RNA和DNA的体外合成。

反应过程中，分别以RNA或DNA为模板，在RNA聚合酶和DNA聚合酶催化作用下，将核苷酸沿着53方向连续延长至3-OH引物末端，形成与模板相同RNA或DNA链基因工程中应用较多的有大肠杆菌DNA聚合酶，T4噬菌体DNA聚合酶，T7噬菌体DNA聚合酶，Taq DNA聚合酶及反转录酶等工 具 酶功 能限制性核酸内切酶识别特异序列，切割DNADNA连接酶催化DNA中相邻的5磷酸基和3羟基末端之间形成磷酸二酯键，使DNA切口封合或使两个DNA分子或片段连接DNA聚合酶合成双链cDNA分子或片段连接缺口平移制作高比活探针DNA序列分析填补3末端基因操作中常用的工具酶工 具 酶功 能Klenow片段又名DNA聚合酶I大片段，具有完整DNA聚合酶I的53聚合、35外切活性，而无53外切活性常用于cDNA第二链合成，双链DNA 3末端标记等逆转录酶合成cDNA替代DNA聚合酶I进行填补，标记或DNA序列分析多聚核苷酸激酶催化多聚核苷酸5羟基末端磷酸化，或标记探针末端转移酶在3羟基末端进行同质多聚物加尾基因操作中常用的工具酶二、载体概念：凡来源于质粒或噬菌体的DNA分子，可以供插入或克隆目的基因DNA并具有运载外源DNA导入宿主细胞能力的片段。

种类：质粒载体 ，噬菌体载体等必须具备的基本条件： 具有独立复制能力 具备多个限制酶的识别位点(多克隆位点) 具有遗传表型或筛选标记 有足够的容量以容纳外源DNA片段 可导入受体细胞一） 质粒： 是存在于细菌染色体外的、能自主复制的双链环状DNA分子 作为克隆载体的质粒应具备以下特点： 1.分子量相对较小，能稳定存在于细菌体内，有较高的拷贝数； 2.具有1个以上的遗传标志，便于筛选； 3.具有多克隆位点 质粒载体质粒载体pBR 322:pBR 322:大大小为小为4363bp4363bp，有一个复，有一个复制起点、一制起点、一个抗氨苄西个抗氨苄西林基因和一林基因和一个抗四环素个抗四环素基因基因质粒质粒pBR 322pBR 322结构示意图结构示意图1.质粒载体pBR 322质粒上有36个单一的限制性内切酶位点，包括Hind、EcoR、BamH、Sal、Pst、Pvu等常用酶切位点而BamH、Sal、Pst分别处于四环素和氨苄青霉素抗性基因（Ampr）中优点：将外源DNA片段在BamH、Sal、Pst位点插入后，可引起抗生素抗性基因失活而方便地筛选重组菌如将一个外源DNA片段插入到BamH位点时，将使四环素抗性基因（Tetr）失活，通过Ampr、Terr来筛选重组体。

1.质粒载体pBR 3222.质粒载体pUC19 是由pBR322和M13噬菌体构建而成的双链质粒载体：（1）2674bp；（2）有Ampr和与M13噬菌体相同的多克隆位点（MCS）；（3）有1个来自E.coil的LacZ基因片断, 编码-半乳糖苷酶，便于蓝白筛选 筛选含pUC19质粒细胞的过程：细胞含有未插入目的DNA的pUC19质粒，在同时含有乳糖操纵子诱导物异丙基-D-硫代半乳糖苷和X-gal（5-溴-4-氯-3-吲哚-D-半乳糖苷）底物的培养基上培养时将会形成蓝色菌落；细胞中含有已经插入目的DNA的pUC19质粒，在同样的培养基上培养将会形成白色菌落2.质粒载体pUC19质粒pUC19的结构示意图组成特点： 双链线状DNA分子， 全长50kb，含66个基因，在其分子两端各含有12个碱基的互补单链，是天然的粘性末端，被称为COS位点噬菌体结构（二）噬菌体载体 是将噬菌体的黏性末端和大肠埃希菌质粒的抗氨卡青霉素和抗四环素基因相连而获得的人工载体，含一个复制起点、一个或多个限制酶切位点、一个COS片段和抗药基因，能插入4050kb的外源DNA，常用于构建真核生物基因组文库三）柯斯质粒原核目的基因原核目的基因的制备的制备真核目的基因真核目的基因的制备的制备目的基因的制备目的基因的制备原生质体融合法原生质体融合法人工化学合成法人工化学合成法通过通过PCR技术制技术制备目的基因备目的基因构建构建cDNA文库文库转化转化转导转导显微注射显微注射电穿孔电穿孔 抗药性筛选法抗药性筛选法互补筛选法互补筛选法重组重组DNA的构建的构建DNA重组体转导入重组体转导入宿主细胞（菌）宿主细胞（菌）重组子的重组子的筛选与鉴定筛选与鉴定基因工程菌构建过程基因工程菌构建过程目的基因 是指所要研究或应用的基因，也是需要克隆或表达的基因。

目的基因来源1） 制备基因组DNA2） 制备cDNA3） 聚合酶链反应4） 人工合成基因一、目的基因的获取（一）原核目的基因的获得 在原核生物中，结构基因通常会在基因组DNA上形成一个连续的编码区域，目的基因在染色体DNA中的含量很少，可以选用合适的限制性内切酶切下目的基因，建立基因组文库基因组文库是将基因组DNA通过限制性内切酶部分酶解后所产生的DNA片段，随机地同相应的载体重组、克隆，所产生的克隆群体代表了基因组DNA的所有序列二）真核目的基因的获得 在真核生物中由于基因结构是由外显子和内含子排列组成，其转录物需要经过剪接去除内含子，使外显子连接加工产生成熟的mRNA，为获得完整的能直接进行表达的真核生物编码的基因常用的方法有构建cDNA文库、聚合酶链反应（PCR）法和化学合成法1.构建cDNA文库 通过反转录法筛选目的cDNAcDNA：以mRNA为模板，在反转录酶作用下合成的互补DNA它是成熟的mRNA的拷贝，不含有任何内含子序列，可以在任何一种生物体中进行表达cDNA文库：将细胞总mRNA反转录成cDNA并获得克隆，由此得到的cDNA克隆群体构建cDNA文库基本步骤包括：mRNA的提纯，该步骤是获取高质量的mRNA是构建高质量的cDNA文库的关键步骤之一。

cDNA第一条链的合成cDNA第二条链的合成双链cDNA的修饰双链cDNA的分子克隆cDNA文库的扩增cDNA文库鉴定评价2.聚合酶链反应（PCR）法 PCR是根据生物体内DNA复制原理在DNA聚合酶催化和dNTP参与下，引物依赖DNA模板特异性地扩增DNA根据已知基因的核苷酸序列，设计引物，进行PCR扩增，获得目的基因变性变性95C延伸延伸72C退火退火Tm-54CPCR由三个基本反应组成：高温变性（94变性） 加热使DNA双螺旋的氢键断裂，双链打开成单链DNA低温退火（54退火）使温度下降，引物与模板DNA中所要扩增的目的序列的两侧互补序列进行配对结合适温延伸（72延伸）在TaqDNA聚合酶、 4dNTPs及Mg2+存在下，引物3端向前延伸，合成与模板碱基序列完合互补的DNA链变性、退火和延伸构成一个循环，每一次循环产物可作为下一次循环的模板，数小时之后（约2530次循环），介于两引物间的目的DNA片段便可扩增105 107拷贝聚合酶链反应的基本原理示意图3.化学合成法 应用DNA测序仪测出某一基因的碱基序列，或根据某一蛋白质的氨基酸组成反推核苷酸序列，再用DNA合成仪通过化学合成原理合成目的基因。

要求：已知目的基因的核苷酸序列或其产物的氨基酸序列 概念：连接酶催化载体DNA与目的基因DNA片段连接，形成重组子，称为DNA分子体外重组连接方式：黏性末端连接、平头末端连接和人工接头等连接二、二、重组DNA的构建黏性末端DNA片段与载体DNA的连接 （一）粘性末端连接 将目的基因和载体用同一种限制酶酶切，产生相同粘性末端，再通过DNA连接酶作用将两者连接起来，构成重组DNA分子 （二）平头末端连接 有些限制酶只能将目的基因和载体DNA切割成平端，此时在T4DNA连接酶的作用下同样能连接起来 三、三、重组DNA转导入受体细胞 将重组DNA导入受体细胞，使重组DNA分子进行扩。