实时荧光定量PCR技术探究进展及应用.doc

实时荧光定量PCR技术探究进展及应用作者单位:473058河南省南阳医学高等专科学校第一附属 医院检验科1研究进展❷二十多年前，美国Perkin-Elmer Cetus公司人类遗传 研究室Mullis等发明了聚合酶链反应(PCR)技术，这成为20 世纪生物医学领域革命性创举与里程碑，使人们梦寐以求的 体外无限扩增核酸片段的愿望成为现实几年后，世界生物 实验室中，PCR技术占据了统治地位，并成为分子生物领域 的关键技术大量特异性PCR产物的生成使许多新的DNA分 析方法的使用成为可能，这些分析方法包括下游修饰或互补 性产物分析技术但是，利用传统的PCR技术进行检测鉴定 时，需要将扩增反应后的电泳进行分离及染色处理，且不能 准确定量，使其应用受到限制1992年，Higuchi最早提出 了实时PCR的设想，它的基本思想是利用荧光染料EB(M化 乙锭)可以插入到双链核酸中受激发光的性质，在PCR反应 的退火或延伸时检测掺入到双链核酸中EB的含量就能实时 监控PCR反应的进程，根据PCR反应的数学函数关系，结合 相应的算法，通过加入标准品的方法，就可以对待测样品中 的目标基因进行准确定量但Higuchi利用的是嵌入荧光染 料检测，它只能简单地反映PCR反应体系中总的核酸量，是 一种非特异性的检测方法。

直到1995年，美国PE公司研制 成功具有革命性意义的荧光定量PCR技术，融合了 PCR高灵 敏性、DNA杂交的高特异性和光谱技术的高精确定量等优点, 直接探测PCR过程中荧光信号的变化，以获得特定区段扩增 产物定量的结果，不需要PCR后处理或电泳检测，完全闭管 操作，克服了常规PCR技术的诸多难题ol996年美国Applied Biosystems公司推出了成熟的实时荧光定量PCR（real-time fluorescent quantitative polymerase chain reaction. FQ-PCR）技术实时荧光定量PCR技术的出现，标 志着DNA分析领域的又一次革命性飞跃这种先进技术，是 在原PCR方法基础上的又一次进展，使高效的DNA定量、定 性分析，以及高灵敏性DNA扩增成为可能这种创新性的PCR 技术可以对DNA扩增过程进行监测❷在荧光定量PCR技术中，有一个很重要的概念-氐值C 代表Cycle（循环），t代表threshold（阈值），Ct值的含义 是：每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循 环数FQ-PCR是通过对PCR扩增反应中每一个循环产物荧光 信号的实时检测，从而实现对起始模板的定量及定性分析。

在实时荧光定量PCR反应中，引入了 一种荧光化学物质，随 着PCR反应的进行，PCR反应产物不断累计，荧光信号强度 也等比例增加每经过一个循环，收集一个荧光强度信号， 这样就可以通过荧光强度变化监测产物量的变化，从而得到 一条荧光扩增曲线图实时荧光定量PCR监测需要专有仪器, 能够通过联机收集每个扩增周期的数据实时荧光定量PCR 仪器通过DNA分子中的荧光染色情况进行PCR扩增产物测 定每个PCR扩增周期的扩增产物的荧光测定结果显示为点 状曲线一般而言，荧光扩增曲线可分为三个典型时期：早 期背景扩增期、中期指数扩增期以及晚期的平台期PCR反 应的前15个循环的荧光信号作为荧光本底信号，荧光域值 的缺省设置是3〜15个循环荧光信号标准偏差的10倍每 个模板的Ct值与该模板的起始拷贝数的对数存性关系, 起始拷贝数越多，Ct值越小利用已知起始拷贝数的标准品 可作出标准曲线，只要获得未知样品的Ct值即可从标准曲 线上计算出该样品的起始拷贝数❷实时荧光定量PCR仪可以使研究人员对DNA扩增情况进 行密切监测，间接通过荧光信号测定，观察PCR产物累计情 况❷实时荧光定量PCR方法有很多类型及亚型，每种方法均 具有特有条件、复杂性及可靠性。

所有这些实时荧光定量PCR 方法均可按照定量方法被分为两种类型-绝对及相对定量 监测方法选择取决于分析复杂性以及最终结果❷绝对定量可对单一靶序列进行定量检测检测结果为绝 对值（例如：病毒载量copies/ml）绝对定量FQ-PCR —般采 用外标准品定量的制备来实现绝对定量，可以通过化学合成 目的基因；或是将PCR扩增产物直接梯度稀释，或是将PCR 产物克隆到载体上，然后抽提出质粒，经过测量浓度和拷贝 数可准确定量，它的优点是稳定、准确质粒DNA和体外转 录的RNA常作为绝对定量的标准品将标准品稀释成不同浓 度的样品，并作为模板进行PCR反应以标准品拷贝数的对 数值为横坐标，以测得的Ct值为纵坐标，绘制标准曲线 对未知样品进行定量时，根据未知样品的Ct值，即可在标 准曲线中定出样品的拷贝数做好标准曲线至关重要，对于 RNA样品，标准品最好是体外转录的RNA,如果用cDNA、PCR 产物作为标准品，虽然制备简单易于保存，但是将会因为标 准品无法准确指示样品反转录效率，而给最终定量起始拷贝 数带来影响绝对定量也具有相应的缺陷，标准品的稳定保 存很难获得成功目前广泛使用的在260 nm波长下定量的 方法与众多因素有关，如水、缓冲液、仪器性能，乃至于核 酸的抽提过程都会影响到结果的稳定性。

这种分析通常见于 研究领域像病毒学与微生物学领域❷相对定量是单一样本中两种不同靶序列浓度比较，检测 结果是靶基因比值相对定量是指在测定目的基因的同时测 定某一内源性管家基因，该管家基因主要是用于核昔酸拷贝 数的比较、反映体系内是否存在PCR扩增的影响因素，通常 选用的管家基因有GAPDH、B -2微球蛋白和rRNAo使用的 B -actin、相对定量较为早期的方法是用一系列已知外参物 做标准曲线，根据该标准曲线得到目的基因和管家基因的 量，再将目的基因同管家基因的比值作为定量的最后结果 此种方法计算出未知样品的量是相对于某个参照物的量而 言，因此，相对定量的标准曲线比较容易制备，对于所用的 标准品只需知道其稀释度即可在整个试验中，待测样品的 量来自于标准曲线，最终必须除以参照基因的量，即参照基 因是1的样本，其他的样本为参照基因的n倍由于管家基 因在各种组织中的恒定表达，所以可用管家基因的量来作为 标准，以比较来源不同的样本，目的基因表达量的差异，此 即相对定量这一方法的缺陷是要求外参、目的基因和管家 基因的扩增效率一致此外加入已知起始拷贝数的内标相当 于是进行双重PCR反应，存在两种模板相互的干扰和竞争。

2实时荧光定量PCR技术的医学应用❷实时荧光定量PCR的应用范围很广泛，已广泛应用于临 床及生命科学研究的各个领域中在科研方面可定量分析各 种基因的表达分析，基因突变和多态性分析，单核昔酸多态 SNP测定及易位基因的检测；在医疗方面可用于免疫组化分 析、临床疾病早期诊断、病原体检测、耐药性分析、肿瘤微 小残留病变研究等❷肿瘤微小残留病变的检测：肿瘤的本质是细胞内基因发 生了变化，是一种多基因异常的疾病，这些异常变化用实时 荧光定量PCR方法都可以检测出来肿瘤疾病尤其是血液的 恶性肿瘤常伴有特异性基因的易位，这种易位往往可以作为 监测临床治疗效果的一种肿瘤标志目前用此方法进行过端 粒酶hTERT基因、慢性粒细胞性白血病ER基因、肿瘤MDR1 基因等，尽管肿瘤发病的分子机制尚未完全阐明，但相关基 因的遗传学改变的积累是致癌性转变的根本原因之一已得 到普遍承认癌基因的突变和表达增加，在许多肿瘤早期就 出现实时荧光PCR技术不仅能有效地检测到基因的突变， 而且可以准确检测癌基因的表达量如定量结直肠癌淋巴结 的癌胚抗原(CEA)mRNA的表达量，可作为诊断癌症微转移的 重要依据虽然在过去的几十年里，治疗方案的改进已明显 地延长了患者的生存期，但是缓解期的患者仍存在复发的危 险性。

因此微小残留病变的检测对于进一步调整治疗方案是 至关重要的实时荧光定量PCR的应用正成为检测肿瘤微小 残留分子标志的一种必备研究工具通过对肿瘤融合基因的 定量测定能指导临床对患者实行个体化的治疗目前的研究 证明用实时荧光定量PCR来检测融合基因有助于对这些患者 的微小残留病变进行定量，其作为预后的指标或对治疗方案 的评估是有价值的同样的方法也被用于定量其他的易位融 合基因水平❷细胞因子的表达分析：许多不同类型的细胞都能分泌低 分子量的蛋白质，其中包括淋巴细胞、抗原递呈细胞、单核 细胞、内皮细胞和成纤维细胞细胞因子可被分为不同的组: 白细胞介素、干扰素、集落刺激因子、肿瘤坏死因子、转化 生长因子和化学因子为了阐明在许多炎症反应，自身免疫 性疾病和器官移植排异中的免疫致病途径，细胞因子mRNA 表达谱的可靠定量是很重要的尽管被检样本中细胞因子含 量往往极低，然而实时荧光反转录PCR以其高敏感性和准确 性在细胞因子的定量中越来越受到青睐使用双色荧光标记 探针，结合不同的引物设计，可以实现对某些先天性疾病的 定量检测应用实时荧光定量PCR方法对B地中海贫血症 （B地贫）患者与V珠蛋白mRNA水平进行检测，其结果特异 性强、定量准确，为了解B地贫的分子病理机制及其临床 诊断提供了可靠的检测数据。

迄今对遗传性物质改变引起的 疾病还无性根治，只能通过产前监测和产前基因诊断，减少 病婴出生因此，实时荧光定量PCR方法可用于产前监测和 产前基因诊断❷病毒感染的定量监测：扩增技术的发展使得对病毒的定 性或定量检测的能力随之提高，也使研究病毒的负荷和疾病 进展的关系成为可能目前运用较多的是在器官移植中对使 用免疫抑制剂的患者用实时荧光定量PCR来定量测定巨细胞 病毒感染研究表明在骨髓移植的患者中用实时荧光定量 PCR检测巨细胞病毒感染比传统的pp65抗原试验更敏感，抗 巨细胞病毒药物治疗能使血中的病毒含量下降目前，用此 方法还进行了对结核分枝杆菌、免疫缺陷病毒、肝炎病毒、 流感病毒、巨细胞病毒、EB病毒、淋球菌、沙眼衣原体，人 乳头瘤病毒等病原体可以进行准确的定量检测同样，在国 内，2004年针对SARS流行性病的检测和诊断使得荧光定量 PCR技术得以应用和发展荧光定量PCR问世后的几年中， 积累了大量有关病原体核酸量与感染性疾病发生、发展和预 后之间关系的资料，这些研究资料不断丰富，将形成感染性 疾病的临床分子诊断标准目前，实时荧光PCR技术已应用 于肝病、性病以及人类免疫缺陷病毒(HIV)等各种病原体的 临床诊断，为实现快速；准确诊断提供了有效的检测方法。