项目二 PDA培养基的配制方法.docx

项目二PDA培养基的配制方法，培养基的湿热灭菌操作一、 目的要求1 •学习并掌握配制培养基的一般方法和步骤2 .学习并掌握棉塞的制作方法二、 培养基的配制原理培养基是人工配制的各种营养物质供微生物生长繁殖的基质，用以培养、分离、鉴定、 保存各种微生物或积累代谢产物在白然界中，微生物种类繁多，营养类型多样，加上实训 和研究的日的不同，所以培养基的种类很多，但不论是何种培养基，均应含有水分、碳源、 氮源、能源、无机盐等不同微生物对pH值要求不一样，所以配制培养基时，还应根据不 同微生物对pH值的要求，将培养基调到合适的pH值范围三、 实训材料和用具琼脂，可溶性淀粉，葡萄糖，10%NaOH, 10%HCl, Imol/LNaOH, lmol/LHCl, KNO3, NaCl, K2HPO4 - 3H2O, MgSO4 • 7H20, FeSO4 - 7H2O；试管,三角瓶,烧杯，量 筒，玻璃棒，天平，牛角匙，PH试纸，棉花，牛皮纸，记号笔，纱布，四、 操作方法与步骤(-)培养基的配制PDA培养基的配制 其配方如下：土豆200g,葡萄糖20g,琼脂15〜20g,水1 OOOmL, pH值白然1) 称量和熬煮 药品实际用量计算后，按培养基配方逐一称取去皮土豆。

土豆切成小 块放入锅中，加水1000ml,在加热器上加热至沸腾，维持20-30min,用可用2层纱布趁 热在量杯上过滤，滤渣奔取滤液补充水分到1000ml2) 加热溶解把滤液放入锅中，加入葡萄糖20g,琼脂15〜20g (提前搞碎)，然后放 在石棉网上，小火加热，并用玻棒不断搅拌，以防琼脂糊底或溢出，待琼脂完全溶解后，再 补充水分至所需最3) 分装 按实训要求，将配制的培养基分装入试管或500ml三角瓶内分装吋可用 三角漏斗以免使培养基沾在管口或瓶口上造成污染分装量：固体培养基约为试管高度的1/5,灭菌后制成斜面，分装入三角瓶内以不超 过其容积的一半为宜；半固体培养基以试管高度的1/3为宜，灭菌后垂直待凝4) 加棉塞 培养基分装完毕后，在试管口或三角烧瓶口上塞上棉塞(或泡沫赠料塞或试 管帽等)，以阻止外界微生物进入培养基内造成污染，并保证有良好的通气性能5) 包扎加塞后，将全部试管用麻绳或橡皮筋捆好，再在棉塞外包一层牛皮纸，以防 止灭菌时冷凝水润湿棉塞，其外再用一道线绳或橡皮筋扎好，用记号笔注明培养基名称、组 别、配制日期二)棉塞的制作棉塞的作川有二：一是防止杂菌污染；二是可过滤空气，保证通气良好，并可减缓培养基水分的熬发，所以正确地制备棉塞是培养基制备中重要的一环。

正确的棉塞是形状、人小，松 紧应与试管口（或三角烧瓶）完全适合过紧则妨碍空气流通，操作不便；过松时，空气会毫无 障碍地进入试管（或三角烧瓶）中，达不到灭菌的目的棉塞过小往往易掉进试管内,因此棉塞 质最的优劣对实训的结果有很人的影响正确的棉塞头较大,加塞吋，应使棉塞长度的1 / 3留 在试管口外，2/3在试管口内（见实训图6・4）目前，有条件的实训室已使用坚周的塑料试管 帽、金属试管帽、硅胶泡沫塞替代棉塞，制作棉塞要选纤维较长的棉花，一般不选用脱脂棉 因为它容易吸水变湿，造成污染，而且价格也贵棉塞制作方法见图6・5实图6・4棉塞（三）斜面与平板培养基的制作斜而与平而培养基是常用的琼脂間体培养基将熬制好的琼脂培养基趁热装入试管灭菌 后摆鞋面，凝固后即成斜面培养基斜面培养基常用于菌种培养、菌种保藏等工作将灭菌 后的琼脂培养基倾注于无菌培养皿中，凝周后即成平板培养基平板培养基常用于分离菌种、 菌落计数、菌落形态观察及菌种鉴定等斜而与平板培养基的制作过程人致为：溶解原料、 融化琼脂、调PH、分装、灭菌和制斜而或平板1、 溶解原料为加速原料的溶解，最好用热水先将原料依次加入到占配制量一半的水中，待全部 溶解后在加足水量。

如配方中有马铃蒋、隸皮、胡罗卜、豆芽等天然原料，需将其熬制约 30min,取出定最滤液，在将所需的其他原料加入滤液中2、 融化琼脂琼脂的用最可灵活掌握用作保藏菌种的培养基，琼脂用量可提高至2.5%,以增加 持水性冬季的气温低，琼脂用量可适当减少琼脂用前可剪成小段，以利于融化待溶 液煮沸是再加入，不断搅拌至完全无琼脂块状物吋再停止加热3、 调整PH用洁净T燥的玻璃棒沾一点培养基滴在试纸上，立即与比色板比较一-般用10%Na0H 或HC1调节4、分装将培养基趁热倒入垫有纱布的漏斗中,使培养基直接滤至试管或三角瓶中，试管装最-般为管高的1/4左右，三角瓶的装量约为其容量的一半勿使培养基玷污容器口部口部塞 有棉塞，试管每7或9支扎一捆，棉塞外而包牛皮纸，以防在灭菌过程中被水汽打湿5、 灭菌分装后的培养基应随即灭菌除特殊情况外，一般培养基均用高压蒸汽灭菌，在104k也 压力卜,灭菌20-30min6、 制作斜面或平板将灭菌后的试管趁热斜置于棍条上，倾斜度以试管中的培养基约占试管长度的1/2为 宜，凝周后即成斜面培养基待灭菌后三角瓶内的培养基冷却至4550时，以无菌操作法 向无菌培养皿中倒入培养基，装萱以刚覆盖整个培养皿底部为宜(约15ml)，凝固后即成 平板培养基。

五、高压蒸汽灭菌法该法使用高压灭菌锅，在I2TC, O. IO5MPa压力下灭菌15〜30min微生物实训所需 的一切器皿、器具、培养基(不耐高温者除外)、无菌水、T作服等物品都可用此法灭菌高压蒸汽灭菌锅是能耐一定压力的密闭金属锅，有立式或卧式(实图8・1、2)两种灭菌锅上附有压力表、排气阀、安全阀、加水口、排水口等卧式灭菌锅还附有温度计 有的还有蒸汽人口灭菌锅的加热源有电、煤气和蒸汽三种高压蒸汽灭菌的操作过程(1) 加水将灭菌锅内层灭菌桶取出，再向外层锅内加入适量的水，以水面与三角架相 平为宜立式锅是直接加水至锅内底部隔板以下1/3处有加水口者由加水口加入至止水 线处2) 装料 将装料桶放冋锅内，装入待灭菌的物品放宜装有培养基的容器时要防止液 体溢出，瓶塞不要紧贴桶壁，以防冷凝水沾湿棉塞3) 加盖 摆正锅盖，对齐螺口，然后以同时旋紧相对的两个螺栓的方式拧紧所有螺栓, 打开排气阀4) 排气 用电炉或煤气加热，待水煮沸后，水蒸气和空气一起从排气孔排出一般认 为，当排气流很强并有嘘声吋，表明锅内空气L1排净(沸后约5min)0(5) 升压 当锅内空气排净吋，即可关闭排气阀，压力开始上升蒸汽供应阀蒸汽进口实图7-2 卧式灭菌锅实图7-1 立式灭菌锅I.安全阀2.压力表 3.放气阀4.软管 5.紧固螺栓6.灭菌桶7.筛架8.水(6) 保压当压力表指针达到所需圧力刻度时，控制热源，开始计吋并维持压力至所需 时间。

本实训用121C、20rnin灭菌7) 降压 达到所需灭菌时间后，关闭热源，让压力自然下降到零后，打开排气阀 放净余下的蒸汽后，再打开锅盖，取出灭菌物品，排掉锅内剩余水8) 无菌检查 将已灭菌培养基冷却后置于37Ctn温箱内培养24h,若无菌生长，则放 人冰箱或阴凉处保存备用4. 化学药品灭菌化学药品消毒灭菌法是用能抑制或杀死微生物的化学制剂进行消 毒灭菌的方法能破坏细菌代谢机能并有致死作用的化学药剂为杀菌剂，如重金属离子筹; 仅阻抑细菌代谢机能，使细菌不能增殖的化学药剂为抑菌剂，如礦胺类及人多抗生素等「化 学药品对微生物的作用是抑菌还是杀菌以及作用效果，还与化学药品浓度的高低、处理微生 物的时间长短、微生物的种类及微生物所处的环境等有关微生物实训室中常用的化学药品有2%煤酚皂溶液俅苏尔)、O. 25%新洁尔灭、0. 1 %升汞、3 %〜5 %的甲醛溶液和75 %乙醇溶液等5. 注意事项(1) 使用高压灭菌锅应严格按照操作程序进行，避免发生事故；灭菌吋，操作者切勿擅 白离开；务必待压力降到零后，才可打开锅盖2) T热灭菌吋电烘箱中物品不要摆得太拥挤，以免阻碍空气流通而影响灭菌效果；灭 菌物品不要与电烘箱内壁的铁板接触，以防包装纸烤焦。

3) 记述高压蒸汽灭菌的操作过程及注意事项六、实验报告(思考题)1. 培养基根据什么原理配制成？牛肉膏蛋白腺培养基中不同成分齐起什么作用？2. 配制培养基有哪儿个步骤?在制备培养基的过程中应注意些什么问题？为什么？3. 记录本实训配制培养基的名称、数量，并图解说明其配制过程，指明要点4. 培养基配制完成后，为什么必须立即灭菌？已灭菌的培养基如何进行•灭菌检杳？。