NDV和APMV-4的F和HN蛋白糖基化位点的差异分析比较.doc

NDV和APMV-4的F和HN蛋白糖基化位 点的差异分析比较袁小远杨金兴张玉霞孟凯奎葱王友令艾武山东省农业科学院家禽研究所本文就禽副黏病毒的两种不同血淸型APMV-1 （以NDV为代表）和APMV-4的F和 HN蛋白糖基化位点进行分析比较分析显示:F蛋白糖基化位点NDV强弱毒株毒 株均有6处糖基化位点，而APMV-4毒株则只有4处潸在的糖基化位点，而且位 置与APMV-1略有不同同时，NDV强毒株GM的HN蛋白有5个潜在的糖基化位 点，而La Sota弱毒株有6个潜在的糖基化位点，即538540位为NKT; APMV-4毒 株有7处潜在的糖基化位点，且位置与APMV-1完全不一致关键词：新城疫病毒;禽副黏病毐;F/HN蛋白；糖基化位点;袁小远（1980.01-）,女，汉，山东荣成人，，研究方向：禽病 分子生物学与免疫学E-mail: xyyuanl980@163. com王友令（1974-）,男，副研允员，研允方向：家禽疫病防控研宄 E-mail:wangyouling71@163. com艾武（1964-）,女，研究员，研究方向：家禽疫病诊断与防治 E-mail:767068849@. com. cno2017-11-17基金：山东省农业科学院青年棊金项A （2014QNM15）:山东省农业科学院科技创 新工程项目（CXGC2016A10）Received： 2017-11-17禽副黏病毒病（Avain Paramyxoviridae virus, APMV）是当今危害全球养禽业 的重要疫病之一，其病原共有九个血清型（APMV广9） U1。

禽副粘病毒1型最 常见的是新城疫病毒（NDV），ND是引起家禽等的一种急性、烈性传染性疾病， 发病率和死亡率均很高，并且多种禽类等都可以感染NDV是禽副黏病毒1型的 代表，也是各型禽副黏病毒型中研宄最为透彻的，而对禽副黏病毒APMV 2~9的 分子特性和致病性知之甚少［2-4］Gen Bank数据库关于APMV-4型的分离毒株信息只有数株，和关研宄非常有限对于APMV-4的研宄现在已获悉:APMV-4可 以从水禽中分离到，可导致病禽的肺炎、支气管炎等呼吸道症状，而且可以在鸡 胚和部分细胞上培殖［5, 6］糖基化作为一种主要的翻译后修饰作用对蛋內质的功能有着重要影响;糖基化位 点能够参与影响病毒蛋G的合成，进而影响其活性和功能因此，通过分析比较 APMV-1和APMV-4的F和HN蛋白糖基化位点的不同，为两者作用机理的研宄提 供科学的理论基础1材料与方法1.1材料1.1.1毒株及背景资料NDV的GM强毒株、疫苗株La Sota和APMV-4 QY毒株均由山东省SPF鸡研宄中 心分离鉴定保存GM强毒株为鸡源基因VII型强毒株，La Sota为基因II型弱 毒疫苗株，APMV-4的QY毒株为鸭源弱毒株。

1. 1.2试剂PCR试剂盒、胶回收试剂盒、载体等均购自宝生物工程(大连)有限公司，Simple RNA kit购自博日生物有限公司1.2方法1.2.1引物设计参照Gen Bank中NDV和APMV4的全基因组序列(No:KU342001和KC439346)设 计4对引物，分别用于扩增F和HN全长基因引物由华大基因公司合成，PAGE plus级别纯化引物碱基序列名称(5,-3,)APMV1-F1ATGGGCTC C A A AC CTTCT ACAPMV1-F2TCACGCTCTTGTGGTGGCTCAPMV1 -HN1TCCGTTCTACCACATCACCAAPMV1-HN2CGTCTTCCCAACCATCCTAAPMV4-F1GCCGGTTGGGAATGCATCGAArIAPMV4-F2A AGC GGGG ATT AC G ATTTTT AAPMV4-HN1CGCCCCACAATGTCCAATCAGAPMV4-HN2CTTGGITATCCCCCTGCAGAGT1. 2. 2 RNA的提取和反转录GM、La Sota、QY毒株的病毒RNA的提取按照Simple RNA试剂盒使用操作说明 进行，最后用20yl DEPC水溶解RNA,立即进行RT操作。

反转录RT按照文献 U1的操作进行，c DNA产物-20C保存1.2.3 PCR扩增、连接和验证APMV-1 和 APMV-4 的 c DNA 产物 5 u 1、2 X pfu PCR Buffer (含 Mg、d NTP plus) 25 u 1、pfu DNA Polymerase (5U/ Ml) 1 M 1、不同的 F 和 R primer (20pmol/ u 1) 各1 y 1，加水补至50p loPCR反应经摸索确定为:95C预变性4min;第一步94C 变性60s、第二步48〜52C退火60s、第三步72C延伸90s,共进行33个循环;72C 后延伸4min;40C保存将扩增得到的GM、La Sota, QY的F和順产物纯化后与 PMD-19T进行连接、转化、PCK反应验证后，阳性质粒送至华大基因测序1.2.4糖基化位点的比较分析各毒株F和HN序列进行拼接后利用DNAStar v6. 13和Mega6. 0进行分析，比较 各个片段的糖基化位点的不同2结果2.1 F和HN基因序列测定和同源性分析经序列测定，APMV-1的GM分离毒F和HN的ORF长度分别为1662、1716bp; La Sot a 为 1662bp 和 1734bp，而 APMV-4 F 和 HN 的 ORF 长度分别为 1701、1698bp。

就 F 基因而言，APMV-4的QY与GM、La Sota的氨基酸同源性为30%、31.6%iHN 基因而言，QY与GM、La Sota的氨基酸同源性为33. 2%、32.6%综上，APMV-1 和APMV-4的F和HN基因的同源性较低2.2 F蛋白糖基化位点分析分析各毒株F蛋白的糖基化位点(即N-X-S/T)的不同之处，结果见表2F蛋 闩糖基化位点U Sota和GM毒株均冇6处糖基化位点，而APMV-4毒株则缺少2 处位点，只有4处潜在的糖基化位点，而且位置与APMV-1略有不同表2 F蛋白糖基化位点的位置 下载原表毒株 F蛋白糖基化位点的位置La Sota 85〜87 191〜193 366〜368 447〜449 47]GM 85 〜87 191-193 366〜368 447 〜449 47]pY 89〜91 20()〜202 - 455 〜457 47$2.3 HN蛋白糖基化位点分析分析各毒株HN蛋0的糖基化位点不同之处，结果见表3NDV强毒株GMHN蛋白 有5个潸在的糖基化位点，而La Sota弱毒株有6个潸在的糖基化位点，即 538〜540位为NKTAPMV-4毒株完全与APMV-1不同，共有7处潜在的糖基化位 点。

从表3可以看出APMV-4与APMV-1的HN蛋白糖基化位点的数量与位置完全 不一致毒株La Sota119〜121341〜343LGM119 〜121341 〜343L0Y7〜954 〜56表3 HN蛋白糖基化位点的位置下载原表3讨论APMV-1的HN、F蛋白是W大糖基化蛋白，也是宿主保护性抗原F蛋白是病毒感 染细胞的必需蛋白，以非活性前体F0的形式存在;经宿主细胞特异性的蛋白酶 水解后F蛋白才能表现出融合活性，通过促进病毒穿入宿主细胞膜而发挥融合 作用M⑽蛋0是NDV中较大的糖蛋白，在识别唾液酸受体、促进细胞融合等 方面有重耍作用［9, 10］HN蛋白在融合的过程能够识别并结合细胞受体APMV-4 毒株基因组全长是15054bp，与副黏病毒的“六规则” 一致;基因组包含6个非 重叠的基因，也是按NP/VMF-HN-L的顺序排列每个基因的两侧是高度保守的转 录起始和停止信号，并丑有长度为9~42nt的间隔序列蛋白质的糖基化是指在糖基转移酶作用下将糖转移至蛋內质，随即和蛋內质上 的氨基酸残基形成糖苷键的过程糖基化作为一种主要的翻译后修饰作用对蛋白 质功能有着重耍修饰作用，例如它对于蛋白质的折叠、运输、定位以及调节蛋白 质功能等方面起着重要作用［11，12］。

因此，对于糖基化位点的研宄意义重大本文在对APMV-1和APMV-4的HN、F基因进行全基因测序的基础上，对其潜在的 糖基化位点进行分析最终确定APMV-4毒株与APMV-1的强毒株和弱毒株F和 HN蛋白糖基化位点存在差异，尤其是HN蛋白，糖基化位点的数量与位置完全不 一致以上研究数据为禽副黏病毒的不同血清型病毒感染和作用机制提供了科学 的研宄基础参考文献[l] Alexander D J.Avian Paramyxoviridac recentdevelopments[J]. Veterinary Microbiology, 1990，23 (1-4) :103-114.[2] Liu X F，Wan H Q，Ni X X，et al. Pathotypical and genotypical characterization of strains of Newcastle disease virus, isolated from outbreaks in chicken and goose flocks in some regions of China duringl985-2001[J]. Archives of Virology, 2003, 148 (7) :1387-1403.[3] Wang KC，Chen GQ，Jiang WM，et al. Complete Genome Sequence of aHemagglutination-Negative Avian Paramyxovirus Type 4 Isolated fromChina[J]. Genome Announcements，2013，1 (2) :eOOCMSlS.[4] Molouki 八，Peeters B.Rescue of recombinant Newcastle disease virus:ashort history of how it all startcd[J]. Archives of Virology，2017，162(7):卜 10.[5] Khattar S K，Nayak B，Kim S 11，et al. Evaluation of the Replication，Pathogenicity， and Immunogenicity of Avian Paramyxovirus (APMV)Serotypes 2，3, 4，5，7，and 9 in Rhesus Macaques[J]. Pl os One，2013，8(10) : e75456.[6] Choi K S， Kim J Y, Kyc S J, et al.Genetic diversity of avian paramyxovirus type 4 isolates from wild ducks in Korea from 2006 to 2011[J]. Virus Genes, 2013, 46 (2) :302-308.[7] 袁小远，杨金兴，王友令，等.一株野禽新城疫强毒分离株的分子特性及其 对不同宿主的致病性[JL农业生物技术学报，2014，22 (3) :273-279.[8] Cardenas-Garcia S，Afonso C L. Rev。