美国药典29微生物限度检查.doc

它山之石““■・USP29“微生物限度检查法"供大家学习参考，我认为USP29 内确实有许多值得我们学习的东西，但在编辑《药典》时也要考虑到我国实际情况， 本着真止能提高药品质量的目的，如一味地照抄照搬别人的东四，就会出现看看药品标准 确实是上去了，体面、拿的出去，但在实际应用时不适宜操作，反而降低了对药品质量的 控制我认为2005年版、2010年版的《中国药典》微生物限度检查法就是如此，2005版 药典执行后就开始需要进行药品的验证工作，相同的药品不同的厂家Z间要验证；既是同 一厂家由于生产原料厂家的改变也要验证，因此各厂家之间岀现了五花八门的都称已经验 证的检验方法，有的说该方法可行，有的乂说该方法不行，天知道这些验证方法的可信度？ 同时又出台了执行药典通知：以后未经验证的检品不能下“微牛物限度检查符合规定”的 结论我国有这么多的药品生产厂家，作为我国药品的监督检验单位，对药品检验来说怎 样去验证，每做一个检品都去验证，这样的工作量现实吗？到今天药典还没有一个对具体 样品经验证后较科学的检验方法或指导性方法我认为现行的“微生物限度检查”法参照USP的方法对具体的样品验证，并按经验证 后的方法进行检验，这确实有利于微牛物的检出率，提升药品检验标准。

但应分步进行： 可先放在“药典附录指导性原则”内，然后再要求药品生产企业对自己生产的品种进行验 证并报地市级以上药品检验所对该方法再次进行检验审核后，再报药典会汇总、审核，在 《中国药典》具体品种项下写入检验方法后再开始实施目前这一步到位的做法，已从2005年版药典实施开始到2010年版的《中国药典》实 施，效果到底怎样？我想：从有关专业杂志的相关文章内也可知一、二<61 >微生物限度检查本章所提供的检测程序用于测定包括原料药及制剂在内的各种药品中需氧菌数量以及 不含有指定的微生物如果已有充分的证据证明某种自动化的方法可以给出与本章所提供 的方法等效的或更好的实验结果，可以用该方法替代本章所提供的方法在实验准备以及 实施的过程中，应遵守无菌操作除另有规定外，本检查法中“孵育”是指 将容器置于温 度控制在30-35C的空气中24-48小时术语“生长”在此处是专用于表示存活的微生物 的增殖预试验（验证试验）应有充分的证据证明在实验条件下检品木身对可能存在微生物的增殖无抑制作用，这 在很大程度上决定了下述所规定的检查方法的结果有效性因此，应进行预试验，测定金 黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、铜绿假单胞菌以及沙门氏菌分别接种到稀释的检品中共同培 养后的存活情况，以使检查标准化并作为随后试验的具体要求。

方法如下：接种1ml金黄 色葡萄球菌、大肠埃希菌、铜绿假单胞菌以及沙门氏菌的24小吋肉汤培养物（稀释度大于 等于10七）至最低稀释级样品供试液中（样胡用pH 7.2磷酸盐缓冲液，大豆■酪蛋白水解物 琼脂培养基或乳糖液体培养基稀释），若微生物在相应的培养基中不能生长，则该部分试骑 无效，有必要按下述步骤对实验进行调整：通过（1）,增加稀释剂的体积，供试品量保持 不变，或（2）在稀释剂中加入足够量的灭活剂；或（3）适当地将（1）和（2）结合使接 种物可以生长可在培养基中加入0.5%的大豆卵磷脂和4.0%的聚山梨酸酯・20以中和供试品中的所存 在的抑菌成分或者用酪蛋白水解物■大豆卵磷脂■聚山梨酸酯・20■培养基按前述方法重复试 验以确认对供试品中的保护剂或其他抗菌剂的中和作用若产品中含有抑菌成分，而该产 品又是可溶的，可采用无菌检查项下产品的无菌检查法中的薄膜过滤法如果在加入灭活剂或大大增加稀释剂的体积后仍不能使上述培养物恢复存活，而且该 产品不适合采用薄膜过滤法，可以作如下推断：所接种微生物的分离培养失败是由于该产 品的抑菌活性此信息表明该产品未被指定（上述给定）的微生物所污染（此信息表明该 产品大概不会被上述给定的微牛物所污染）。

应继续进行监测以建立该产品的抑菌谱和杀菌 活性范围缓冲液和培养基培养基既可以按以下处方配制，也可以使用生产者或销售商推荐的，与该配方相类似 的脱水培养基按以下程序配制培养基：将可溶性固体溶解在水中，必要时可加热促使其完全溶解， 用HCI或NaOH溶液调节培养基的pH使其在使用时达到规定值在25 士 2C时测定pH 值如果配方中有琼脂，则琼脂的含水量不应超过15%,配方中的水均应为纯水PH 7.2磷酸盐缓冲液储备液一在1000ml容量瓶中将磷酸二氢钾KH2PO434g （monobasic potassium phosphate）溶于约500ml水中，用NaOH TS （约175ml）调节pH至7.20.1加水至 刻度，混匀分装，灭菌冷藏保存备用培养基除非另有规定，培养基均应采用高压蒸汽灭菌方式（见灭菌项＜1211＞下，蒸汽灭菌）， 灭菌时间取决于待灭菌的培养基的体积I.酪蛋白月东■大豆卵磷脂■聚山梨醇酯20液体培养呈Pancreatic Digest of Casein酪蛋白胰酶消化物（胰酪腺）20 gSoy Lecithin大豆卵磷脂5 gPolysorbate 20聚山梨醇酯2040 mLWater水960 mL将酪蛋白豚、大豆卵磷脂溶解在960ml水中，在温度为48・50。

C水浴中加热约30分 钟使其完全溶解加40ml聚山梨醇酯20混合，按所需量分装II. 大豆•酪蛋口水解物琼脂培养基Pancreatic Digest of Casein酪蛋白胰酶水解物（胰酪淼）15.0 gPapaic Digest of Soybean Meal大豆木瓜酶水解物5.0 gSodium ChlorideNaCI5.0 gAgar琼脂15.0 gWater水1000 mL灭菌后 pH7.30.2oIII. 大豆•酪蛋白水解物培养基按无菌检查项v71＞下大豆■酪蛋白水解物培养基的配制方法进行IV. 甘露醇•盐琼脂培养基Pancreatic Digest of Casein酪蛋白胰酶消化物（胰酪腺）5.0 gPeptic Digest of Animal Tissue动物组织胃酶水解物5.0 gBeef Extract牛肉浸取物1-OgD-MannitolD-甘露醇10.0 gSodium ChlorideNaCI75.0 gAgar琼脂15.0 gPhenol Red酚红0.025 gWater水1000 mL将上述成分混合后，加热并不停不断地搅动，煮沸1分钟使之完全溶解灭菌后pH7.40.2.V. Baird-Parker琼脂培养基Pancreatic Digest of Casein酪蛋白胰酶消化物（胰酪豚）10.0 gBeef Extract牛肉浸取物5.0 gYeast Extract酵母浸取物1-0gLithium Chloride氯化锂5.0 gAgar琼脂20.0 gGlycine甘氨酸12.0 gSodium Pyruvate丙酮酸钠10.0 gWater水950 mL边加热边搅拌，煮沸一分钟。

灭菌，冷却至45C- 50C,加入10ml灭菌的1 %亚硏酸 钾溶液、50ml蛋黄乳化液，轻轻混合均匀，倾注平皿卵黄乳化液制备：将蛋壳表面消 毒，无菌条件下打开蛋壳，将完整的蛋黄分离至无菌量筒中加入无菌盐水TS,使蛋黄 与盐水比为3 :7O转移至一无菌搅拌杯中高速搅拌5秒钟灭菌后pH6.80.2.VI. Vogel-Johnson 琼脂培养基Pancreatic Digest of Casein酪蛋白胰酶水解物（胰酪腺）10.0 gYeast Extract酵母浸取物5.0 gMannitol廿露醇10.0 gDibasic Potassium Phosphate 磷酸氢二钾5.0 gLithium Chloride氯化锂5.0 gGlycine甘氨酸10.0 gAgar琼脂16.0 gPhenol Red酚红25.0 mgWater水1000 mL将固溶体（固体溶液）煮沸1分钟，灭菌，冷却至45C— 50C,加入灭菌的1%亚硝酸钾溶液灭菌后pH7.20.2oVII. Cetrimide琼脂培养基Pancreatic Digest of Gelatin明胶胰酶水解物20.0 gMagnesium Chloride氯化镁1.4 gPotassium Sulfate硫酸钾10.0 gAgar琼脂13.6 gCetyl Trimethylammonium Bromide (Cetrimide)漠化十六烷基三甲胺0.3 gGlycerin甘油（丙二•醇）10.0 mLWater水1000 mL将所有的固态成分溶于水后，加入甘油，边搅动边加热，煮沸1分钟使之完全溶解。

灭菌后pH7.202VIII.用于荧光检测的假单胞菌琼脂培养基Pancreatic Digest of Casein酪蛋白胰酶消化物10.0 gPeptic Digest of Animal Tissue动物组织胃酶消化物10.0 gAnhydrous Dibasic Potassium Phosphate 无水磷酸氢二钾(K2HPO4 )1.5gMagnesium Sulfate (MgSO4)硫酸镁1.5gGlyceri n甘油10.0 mLAgar琼脂15.0 gWater水1000 mL将固态成分溶于水后，加入廿油，边搅动边加热，煮沸1分钟使之完全溶解灭菌后 pH7.20.2oIX.用于检测绿脓菌素的假单胞菌琼脂培养基Pancreatic Digest of Gelatin 明胶胰酶消化物20.0 gAnhydrous Magnesium Chloride 无水氯化镁(MgCI2)1.4gAnhydrous Potassium Sulfate 无水硫酸钾(K2SO4)10.0 gAgar 琼脂15.0 g1Glycerin 甘油10.0 mLWater 水1000 mL将固态成分溶于水后，加入甘油，边搅动边加热，煮沸1分钟使Z完全溶解。

灭菌后 pH7.20.2.X.乳糖培养基Beef Extract牛肉浸提物3.0 gPancreatic Digest ofGelatin明胶胰酶消化物5.0 gLactose乳糖5.0 gWater水1000 mL灭菌后尽快冷却，灭菌后pH6.9 0.2.XI •亚硒酸盐•胱氨酸培养基Pancreatic Digest of Casein酪蛋白胰酶消化物5.0 gLactose乳糖4.0 gSodium Phosphate磷酸钠10.0 gSodium Acid Selenite亚硒酸钠4.0 gL-CystineL■胱氨酸10.0 mgWater水1000 mL最终 pH: 7.0 0.2混合，加热使之溶解用流动蒸汽加热15分钟，不要高压灭菌XII. 连四硫酸盐培养基Pancreatic Digest of C。