电磁脉冲辐照对小鼠血睾屏障早期影响及tgfβ3表达意义.doc

电磁脉冲辐照对小鼠血睾屏障早期影响及TGFB3表达意义作者：彭页，程义成，梅盛林，张远强张金山，侯武刚【摘要】目的探讨电磁脉冲（EMP）辐射后小鼠血 睾屏障的结构和通透性早期 损伤及TGF |3 3在其中的作用方法 常规HE染色和硝酸鋼示踪电镜技术观察400 kV/m电磁脉冲辐射后2~48 h内小鼠睾丸血 睾屏障结构和通透性的动态改变； 免疫组织化学染色和图像分析技术检测TGF |3 3在不同时间的表达规律结果400 kV/m电磁脉冲辐射后48 h内生精细胞变性、凋亡与坏死逐渐增多，支持细胞及 其紧密连接发生形态变化，血 睾屏障结构损伤，各时间点TGFP3表达强度（灰 度值）持续性显著增强（均P<0・05）,提示其通透性明显升高，于辐照后2 h 即见发生上述血睾屏障的结构和通透性变化的时间和程度具有一致性结论 EMP辐射后早期小鼠血 睾屏障的结构和通透性迅速发生损伤，TGFI3 3可能在其 损伤中发挥重要作用关键词】电磁脉冲；辐射；硝酸镉；睾丸；TGF |33Abstract: Objective To study the early influnce of blood Leslis barrier induced by electromagnetic pulse irradiation in mouse and the mechanism of action of TGF |3 3 expression in this process. Methods Routine HE staining and lanthanum tracing electron microscopy were used to observe the influence of 400 kV/m electromagnetic pulse irradiation on mouse blood test is barrie wi thin 2 ~ 48 h. ImmunohistochemicaI method and image analysis were used to analyze the possible role of TGF (3 3 in this process. Results After 400 kV/m electromagnetic pulse irradiation, spermatogenic cells presented degeneration, apoptosis and necrosis, the shape and structure of SertolV s cel 1 and tight junction were changed, blood testis barrier was injuried seriously and i Is permeabi1ily increased within 48 h. TGF p 3 mainly expressed in the cytoplasm of Leydig，s cells and interstitial tissue, and its expression persistently increased within 2 ~ 48 h (P& lt;0.05) • Conclusion The structural and functional damages of mouse blood testis barrier rapidly occurred after electromagnetic pulse irradiation, and TGF p 3 may play an imporlanl role in this damaging process.Key words: electromagnetic pulse radiation; lanthanum; testis; blood testis barrier; TGF P 3电磁脉冲(Electromagnetic pulse, EMP)是一种高能、超宽频谱电磁波，在未 来民用和军事领域均会有广泛的运用，其生物学效应已受到各国学者广泛的关注［1L睾丸是EMP高度敏感器官之一 ［2］。

既往研究大多侧重于睾丸生精上皮和 间质细胞，且多仅为中晚期损伤效应，迄今罕有对血睾屏障影响的报道本研 究采用常规苏木精 伊红染色（Hematoxylin Eosin staining, HE ）＞硝酸铺示 踪电镜，观察400kV/m电磁脉冲辐射后2~48 h内小鼠睾丸血 睾屏障结构和通 透性的变化，并结合 TGF （3 3 （ transforming growth factor beta 3 ）在小鼠睾 丸内表达的变化，分析其在小鼠血 睾屏结构改变中可能的作用，为电磁脉冲辐 射对生殖器官的损伤与防治提供理论基础1材料和方法［*2］1. 1试验动物与分组8周龄Balb/c雄性小鼠30只，体重（251） g,本校试 验动物中心提供随机分为400 kV/m辐射组与对照组各15只各组小鼠分别在 辐射后2, 6, 12, 24和48 h随机各取3只处理1.2照射条件将辐射组小鼠分别装入有机玻璃盒内，垂直置于辐射场中，接受场强为400 kV/m 全身照射，前沿3 ns,脉宽340 ns,脉冲间隔25 s,共计200个电磁脉冲，对 照组小鼠也置于同样的环境中假照射1.3实验方法及步骤［*2］ 1.3.1 HE染色与电镜观察辐射组与对照组小鼠分别于 辐射后上述五个时间点各取3只，在戊巴比妥钠腹腔注射（40 mg/Kg）麻醉下， 取双侧睾丸，左侧睾丸固定于Bouin5 s液24 h,常规脱水石蜡包埋，连续切片（4 pm）,裱贴于三 氨丙基三乙氧硅烷（3 Mino propyl triethoxy silane, APES ）处理过的载波片上，行常规HE染色；右侧睾丸迅速固定于鋼醛固定液，随 即切为1 mm2大小继续固定2 h,用含匍的0. 1 mol/L二甲碑酸钠缓冲液浸洗3 次，每次10 min,然后用不含匍的10 g/L四氧化餓（0s04 ）固定2h,经二甲碑 酸钠缓冲液浸洗后常规电镜梯度丙酮脱水，Epon 812包埋，LKB NoVa型超薄 切片机切片，用JEM 2000EX型电镜观察［3 ］。

1. 3. 2 TGFp 3免疫组织化学ABC法［4］石蜡切片常规脱蜡后入3%甲醇 H2O2封闭内源性过氧化物酶30 min; 1%山羊血 清室温孵育30 min M闭背景IgG,倾去血清，加TGF 0 3兔抗多克隆抗体（1 ： 100）, 4C冰箱孵育过夜；生物素标记二抗（羊抗兔IgG, 1 : 300 ）室温2 h; ABC复合 物（1 ： 200 ）室温lh;镜下掌握DAB显色;以上各步间均用0. 01Mol/LPH7. 3PBS 冲洗5 minx 3次，脱水透明封片（部分切片苏木精复染8-10 s ）阴性对照用 PBS代替一抗，其他步骤同上1. 3. 3图像分析各组随机选取5张TGFI3 3免疫组织化学切片，在图像分析仪下（Zeiss）测量灰度 值，重复5次以相应背景灰度值减去各次测量灰度值后的平均值作为该时相该 型生精细胞的最终灰度值［5］,结果以XS表示，采用Excel统计软件作折线图, 直观反映TGFP3表达的变化，采用SPSS11.5统计软件进行数据处理，用方差分 析统计不同时期间差异2结果”2]2.1 HE染色观察HE染色结果显示，正常对照组生精小管内生精上皮排列规则， 无明显生精上皮的脱落、坏死（图1）。

在4 00 kV/m电磁脉冲辐射组，辐射后2h 即可见生精小管管腔内生精细胞变性、少数凋亡、坏死及脱落，以精母细胞居多， 基底室内出现细胞缺损，伴精原细胞核浓缩，支持细胞胞核明显缩向基底面，并 与生精细胞相分离；辐射后6 h, 12 h和24 h,以上现象有加重的趋势；辐射后 48h,部分生精小管内出现基底室与近腔室的分离，生精小管基膜不同程度增厚, 局部缺损，间质水肿，毛细血管轻度扩张，内皮细胞核浓缩变性，基底膜轻度增 厚，显示血 睾屏障结构明显损伤（图2）2.2电镜观察在正常对照组，各级生精细胞、支持细胞和紧密连接结构清晰，鋼颗粒在生精小 管沉淀于基膜和基底室内精原细胞与细线前期精母细胞间（图3）在400 kV/m 电磁脉冲辐射组，各级生精细胞不同程度胞核浓缩变性，少数细胞呈现凋亡图象（核染色质浓缩边集，沿核膜呈圆环形或半月形），或坏死，尤以精原细胞和精子 细胞为明显，同时，支持细胞紧密连接部分结构裂解破坏，或模糊不清，并见镉 颗粒更广泛沉淀于各级生精细胞间，其中辐射后2 h即可见到匍颗粒突破支持细 胞紧密连接，在近腔室内精母细胞、圆形精子细胞、精子间均可见沉淀（图4）; 辐射后6 h, 12 h,24 h和48 h,在生精小管内还可见逐渐增多的凋亡与坏死的生 精细胞，以细线前期精母细胞与晚期粗线期精母细胞居多。

2.3 TGFP3免疫组 织化学ABC法在正常对照组，TGFI3 3在小鼠睾丸内主要表达于间质细胞胞质，而于间质成分 （如毛细血管内皮细胞、纤维细胞等）仅极弱阳性或弱阳性，在生精小管管腔内 未见阳性表达（图5）400 kV/m电磁脉冲辐射后，TGFI3 3的表达明显增强，灰 度值测定结果显示，辐射组各时间点均与正常对照组之间持续有显著性差异（P< 0. 05 ）,但辐射后各时间点之间无显著差异（P > 0. 05）,见表1、图6 表1辐照后不同时间TGFP3平均灰度值的比较3讨论国内外研究显示，电磁脉冲辐射可对中枢神经系统、内分泌系统、心血管系统、 免疫系统和视觉系统等多系统、多脏器造成损伤对生殖系统的研究发现，小鼠 接受不同强度的电磁脉冲辐射后，睾丸的各级生精上皮均遭到不同程度的损伤， 其中精原细胞、精子细胞和精子是最敏感靶细胞[6];电镜结果显示小鼠睾丸间 质细胞亦遭到严重破坏[7],属于电磁脉冲辐射高度敏感细胞之一然迄今尚罕 见有关对血 睾屏障影响，特别是辐照后早期影响的报道我们的研究主要集中在电磁脉冲辐射对小鼠睾丸血睾屏障结构及功能的早期 影响，并对相关机制进行初步探讨。

众所周知，血 睾屏障是睾丸的重要结构， 为精子的发生提供了稳定的微环境，一旦其结构基础受到损伤，势必影响其功能, 从而进一步影响到精子的发生血睾屏障的结构主要包括毛细血管内皮及其基 膜、结缔组织、生精上皮基膜和支持细胞紧密连结紧密连结是构成血 睾屏障 的主要结构［8］这种支持细胞紧密连结复合结构将生精小管的的生精上皮分为 基底室和近腔室两部分，为研究血 睾屏障结构提供了便利通过HE染色和硝酸 鋤示踪电镜，我们发现，400 kV/m电磁脉冲辐射后2-48 h内逐渐增多的大量生 精细胞脱落入管腔，以细线前期精母细胞与晚期粗线期精母细胞居多；支持细胞 胞核明显缩向基底面，突起明显减少，紧密连结结构发生破坏，部分生精小管内 出现基底室与近腔室的分离，同时，血 睾屏障的其他结构(毛细胞血管内皮及 其基膜、结缔组织、生精上皮基膜)也发生损伤；特别是辐射后2 h即可见匍颗 粒突破支持细胞紧密连接，在近腔室内精母细胞、圆形精子细胞、精子间都可见 沉淀以上结果均提示，电磁脉冲辐射后48 h内，不仅生精细胞受到损伤，支持 细胞也受到损害，进而影响血睾屏障的结构，使其通透性明显升高在观察到血 睾屏障结构损伤和通透性升高的同时，我们通过免疫组织化学染色 及灰度值定量分析，探讨TGFP3在电磁脉冲辐射后小鼠睾丸损伤中可能发挥的作 用和机制。

有文献报道，在体内和体外试验均证实，TGF(3 3可能通过p38MAPK信 号途径调节 o ccludin, c laud in 11 和 ZO 1 (zonula occludens 1)蛋白的 水平，从。