DNA的粗提取与鉴定.ppt

　　　DNA的粗提取与鉴定一.DNA在氯化钠溶液中的溶解度，是随着氯化钠的浓度的变化而改变的当氯化钠的物质的量浓度为0.14 mol/L时，DNA的溶解度最低利用这一原理，可以使溶解在氯化钠溶液中的DNA析出实验原理实验原理: :二二.DNA.DNA不溶于酒精溶液，但是细胞中的某些物质则可以溶不溶于酒精溶液，但是细胞中的某些物质则可以溶于酒精溶液利用这一原理，于酒精溶液利用这一原理，可以进一步提取出含杂质较可以进一步提取出含杂质较少的少的DNADNA三三.DNA.DNA遇二苯胺（沸水浴）会染成蓝色，因此，遇二苯胺（沸水浴）会染成蓝色，因此，二苯二苯胺可以作为鉴定胺可以作为鉴定DNADNA的试剂目的要求:初步掌握DNA的粗提取和鉴定的方法，观察提取出来的DNA物质材料用具:　　　鸡血细胞液①（5 ～10 mL）　　　铁架台，铁环，镊子，三角架，酒精灯，石棉网，载玻片，玻璃棒，滤纸，滴管，量筒（100 mL，1个），烧杯（100 mL，1个，50 mL、1 000 mL各2个），试管（20 mL，2个），漏斗，试管夹，纱布　　　　体积分数为95%的酒精溶液（实验前置于冰箱内冷却24 h），蒸馏水，质量浓度为0.1 g/mL的柠檬酸钠溶液，物质的量浓度分别为2 mol/L和0.015 mol/L的氯化钠溶液，二苯胺试剂。

　方法步骤•取质量浓度②为0.1 g/mL的柠檬酸钠溶液（抗凝剂）100 mL，置于500 mL烧杯中将宰杀活鸡流出的鸡血（约180 mL）注入烧杯中，同时用玻璃棒搅拌，使血液与柠檬酸钠溶液充分混合，以免凝血然后，将血液倒入离心管内，用1 000 r/min（转每分）的离心机离心2 min，此时血细胞沉淀于离心管底部实验时，用吸管除去离心管上部的澄清液，就可以得到鸡血细胞液如果没有离心机，可以将烧杯中的血液置于冰箱内，静置一天，使血细胞自行沉淀制备鸡血细胞液制备鸡血细胞液，，制备的方法是：制备的方法是：•思考题思考题：：1.1.为什么要吸去上清液取沉淀物？2.2.生活在牧区的人们，采集牛、羊和马血比较方便，他生活在牧区的人们，采集牛、羊和马血比较方便，他们能否选用牛、羊、马血做实验材料？为什么？们能否选用牛、羊、马血做实验材料？为什么？答案：1.上清液是血浆不含血细胞，血细胞沉淀在试管底部细胞核含DNA2.2.不能因为哺乳动物成熟的红细胞中无细胞核，不能因为哺乳动物成熟的红细胞中无细胞核，仅靠白细胞和淋巴细胞中的少数仅靠白细胞和淋巴细胞中的少数DNADNA，在实验中很，在实验中很难提取到难提取到。

注意：注意：盛放鸡血细胞液的容器，最好是塑料容器盛放鸡血细胞液的容器，最好是塑料容器鸡血细胞破碎以后释放出的鸡血细胞破碎以后释放出的DNADNA，容易被玻璃容，容易被玻璃容器吸附，由于细胞内器吸附，由于细胞内DNADNA的含量本来就比较少，的含量本来就比较少，再被玻璃容器吸附去一部分，提取到的再被玻璃容器吸附去一部分，提取到的DNADNA就会就会更少因此，实验过程中最好使用塑料的烧杯和更少因此，实验过程中最好使用塑料的烧杯和试管，这样可以减少提取过程的试管，这样可以减少提取过程的DNADNA的损失1.提取鸡血细胞的细胞核物质•将制备好的鸡血细胞液5 ～10 mL，注入到50 mL烧杯中向烧杯中加入蒸馏水20 mL，同时用玻璃棒沿一个方向快速搅拌5 min，使血细胞加速破裂然后，用放有纱布的漏斗将血细胞液过滤至1 000 mL的烧杯中，取其滤液 思考思考3:3:加入蒸馏水的目的是什么？为什么能达到此加入蒸馏水的目的是什么？为什么能达到此目的？目的？答案：答案：加速了鸡血细胞的破裂加速了鸡血细胞的破裂( (细胞膜和核膜的破裂细胞膜和核膜的破裂) )，从而释放出，从而释放出DNADNA；蒸馏水对于鸡血细胞来说是一种低；蒸馏水对于鸡血细胞来说是一种低渗液体，水分可以大量进入血细胞内，使血细胞胀裂。

渗液体，水分可以大量进入血细胞内，使血细胞胀裂2.溶解细胞核内的DNA•将物质的量浓度为2 mol/L的氯化钠溶液40 mL加入到滤液中，并用玻璃棒沿一个方向搅拌 1min，使其混合均匀，这时DNA在溶液中呈溶解状态•思考：为什么用2 mol/L的氯化钠溶液？为什么玻璃棒沿一个方向搅拌 ？•答案：DNA在2 mol/L的氯化钠溶液中溶解度最大防止DNA断裂3.析出含DNA的黏稠物•沿烧杯内壁缓缓加入蒸馏水，同时用玻璃棒沿一个方向不停地轻轻搅拌，这时烧杯中有丝状物出现，继续加入蒸馏水，溶液中出现的黏稠物会越来越多当黏稠物不再增加时停止加入蒸馏水这时溶液中氯化钠的物质的量浓度相当于0.14 mol/L思考题：此时加入蒸馏水的目的是什么？思考题：此时加入蒸馏水的目的是什么？答案：答案：使氯化钠溶液浓度接近使氯化钠溶液浓度接近0 0．．14mol/L14mol/L，使，使DNADNA最大限度地析出最大限度地析出5.将DNA的黏稠物再溶解•　　取一个50 mL烧杯，向烧杯内注入物质的量浓度为2 mol/L的氯化钠溶液20 mL用钝头镊子将纱布上的黏稠物夹至氯化钠溶液中，用玻璃棒沿一个方向不停地搅拌3 min，使黏稠物尽可能多地溶解于溶液中。

4.滤取含DNA的黏稠物用放有多用放有多层纱布的漏斗，布的漏斗，过滤步步骤3中的溶液至中的溶液至1 000 mL的烧杯中，含的烧杯中，含DNA的黏稠物被留在纱布上的黏稠物被留在纱布上思考题：思考题：这次过滤与上次过滤的目的一样吗？为什么？这次过滤与上次过滤的目的一样吗？为什么？答案：答案：不一样；这次过滤是为了去除溶于氯化钠溶不一样；这次过滤是为了去除溶于氯化钠溶液的杂质，而上次过滤是为了去除破裂的细胞膜等液的杂质，而上次过滤是为了去除破裂的细胞膜等物质6.过滤含有DNA的氯化钠溶液•取一个100 mL烧杯，用放有两层纱布的漏斗过滤步骤5中的溶液取其滤液，DNA溶于滤液中思考题：思考题：这一步骤的目的是什么？为什这一步骤的目的是什么？为什么反复地溶解与析出么反复地溶解与析出DNADNA，能够去除杂质，能够去除杂质？？答案：答案：除去含有除去含有DNADNA滤液中的杂质；滤液中的杂质；用高盐浓度的溶液溶解用高盐浓度的溶液溶解DNADNA，能除去在高盐中不能，能除去在高盐中不能溶解的杂质；用低盐浓度使溶解的杂质；用低盐浓度使DNADNA析出，能除去溶解析出，能除去溶解在低盐溶液中的杂质在低盐溶液中的杂质。

因此，通过反复溶解与因此，通过反复溶解与析出析出DNADNA，就能够除去与，就能够除去与DNADNA溶解度不同的溶解度不同的多种杂质多种杂质7.7.提取含杂质较少的提取含杂质较少的DNADNA　在上述　在上述滤过的溶液中，加入冷却的、体的溶液中，加入冷却的、体积分数分数为95%的的酒精溶液酒精溶液50 mL，并用玻璃棒沿一个方向搅拌，溶液中会出，并用玻璃棒沿一个方向搅拌，溶液中会出现含杂质较少的丝状物用玻璃棒将丝状物卷起，并用滤现含杂质较少的丝状物用玻璃棒将丝状物卷起，并用滤纸吸取上面的水分这种丝状物的主要成分就是纸吸取上面的水分这种丝状物的主要成分就是DNA思考题：这一步骤的目的是什么？为什么加入的酒精需要思考题：这一步骤的目的是什么？为什么加入的酒精需要冷却的？冷却的？答案：答案：去除溶于酒精的杂质；去除溶于酒精的杂质；可抑制核酸水解酶的活性，防止降解可抑制核酸水解酶的活性，防止降解DNADNA；降低分子的；降低分子的运动，易于形成沉淀析出；低温有利于增加运动，易于形成沉淀析出；低温有利于增加DNADNA分子柔分子柔韧性，减少断裂韧性，减少断裂因此，因此，使用冷却的酒精，对使用冷却的酒精，对DNA的的凝集效果较佳凝集效果较佳。

8. DNA的鉴定•取两支20 mL的试管，各加入物质的量浓度为0.015 mol/L的氯化钠溶液5 mL，将丝状物放入其中一支试管中，用玻璃棒搅拌，使丝状物溶解然后，向两支试管中各加入4 mL的二苯胺试剂混合均匀后，将试管置于沸水中加热5 min，待试管冷却后，观察并且比较两支试管中溶液颜色的变化思考题：为什么要设置对照组？实验中能观察到什思考题：为什么要设置对照组？实验中能观察到什么现象？么现象？ 答案：答案：确定二苯胺不与氯化钠发生颜色反应；确定二苯胺不与氯化钠发生颜色反应；实验组试管中可看到溶液变蓝色实验组试管中可看到溶液变蓝色•【例l】 下图为“DNA的粗提取与鉴定”的实验示意图，其正确的操作顺序是 • 解析 DNA位于鸡血细胞的细胞核中采用加蒸馏水并且搅拌的方法，可使鸡血细胞大量吸水胀破，细胞膜、核膜破坏，搅拌的机械作用更加速了细胞的破裂．释放出的核物质其实是DNA、RNA和蛋白质的混合物在浓度较高的氯化钠溶液中核蛋白质容易解聚，DNA的溶解度也很高，经过滤便分离出含少量杂质的DNA根据DNA在冷却的95％的酒精中凝集反应强烈的性质，进一步纯化DNA将DNA溶解于较高浓度的氯化钠溶液中，加入冷却的95％的酒精溶液，可使DNA沉淀、浓缩，形成含杂质较少的DNA丝状物。

答案:D•1次加酒精:第7步析出含杂质较少的DNA•2次加蒸馏水：第1步（血细胞胀破）• 第3步（稀释氯化钠溶液）•3次过虑： 第1步（DNA存在于滤液中）• 第4步（DNA留在纱布上）• 第5步（DNA存在于滤液中）•4次调整氯化钠浓度：第2步2mol／L、第3步0.14 mol/L、第5步2mol／L、第8步0.015 mol/L的•5次使用玻璃棒搅拌：第1步（血细胞胀破）、第2步第5步（加速DNA溶解）、第3步（稀释氯化钠溶液析出DNA）、第7步（提取含杂质较少的提取含杂质较少的DNADNA））（整个实验共7次，提取核物质，鉴定)口诀：柠檬离心一水滤，二钠三水四粘滤， 五钠六滤七酒析，八胺沸浴蓝取绿练习1．在破碎血细胞时，要先加入20 mL的蒸馏水，其作用是A．DNA溶解水中 B．血细胞破裂，DNA释放 C．稀释血液，防止凝固 D．有利于搅拌2．用过滤的方法得到细胞中的氯化钠溶液后，还要用酒精处理，可以得到较纯化的DNA．这是因为： A．DNA易溶于酒精，而滤液中某些杂质不易溶于酒精 B．DNA不易溶于酒精，而滤液中某些杂质易溶于酒精 C．DNA和滤液中其他成分更易溶于酒精 D．DNA和滤液中其他成分都不溶于酒精3、与析出DNA粘稠物有关的叙述，不正确的是 　　A.操作时缓缓滴加蒸馏水，降低DNA的溶解度 　　B.在操作A时，用玻璃棒轻缓搅拌，以保证DNA分子完整 　　C.加蒸馏水可同时降低DNA和蛋白质的溶解度，两者均可析出　　D.当丝状粘稠物不再增加时，此时NaCl的浓度相当于0.14mol/L4、在向溶解DNA的NaCl溶液中，不断加入蒸馏水的目的是 A.加快溶解DNA的速度 B.加快溶解杂质的速度 　　C.减少DNA的溶解度，加快DNA析出 D.减小杂质的溶解度，加快杂质的析出答案答案1 1．．B 2B 2．．B B 3 3、、C C 4 4、、C C 6．在进行DNA粗提取实验时，为得到含DNA的黏稠物，某同学进行了如下操作： 在新鲜鸡血中加入适量的柠檬酸钠，经离心后，除去血浆留下血细胞备用。

取5―10ml血细胞放入50ml的塑料烧杯中，并立即注入20ml 0.015mol／L的氯化钠溶液，快速搅拌5分钟后经滤纸过滤，取得其滤液滤液中加入40ml 2mol／L的氯化钠溶液，并用玻璃棒沿一个方向快速搅拌1分钟上述溶液中缓缓加入蒸馏水，同时用玻璃棒沿一个方向不停地轻轻搅拌，直到溶液中出现丝状物为止，再进行过滤而得到含DNA的黏稠物实验结果是：所得到的含DNA的黏稠物极少，导致下一步试验无法进行1 1）指出并改正上述实验操作中的错误：）指出并改正上述实验操作中的错误：　　　　　　　　　　　　 　　 (2) (2) 要进一步提取要进一步提取DNADNA时需加入冷却的酒精时需加入冷却的酒精，，作用是作用是　　　　和和　　　　答案答案（（1 1））“20ml 0.015mol“20ml 0.015mol／／L L的氯化钠溶液的氯化钠溶液””错误，应改为错误，应改为“20ml“20ml蒸馏水蒸馏水””““经滤纸过滤经滤纸过滤””错误，应改为错误，应改为““经纱布过滤经纱布过滤” ” ““直到溶液中出现丝状物为止直到溶液中出现丝状物为止””错误，应改为错误，应改为““直到溶液中丝直到溶液中丝状物不再增加时为止状物不再增加时为止””（（2 2）凝集）凝集DNA DNA 溶解其他细胞物质溶解其他细胞物质 •8、DNA的粗提取与鉴定的实验(如下图)：•(1) 本实验材料选用鸡血细胞液而不是用鸡的全血，主要原因是由于鸡血细胞液中含有较高含量的____________。

•(2) 图A中加入蒸馏水的目的是_________________•(3) 通过图B所示步骤取得滤液后，再向滤液中加入2 mol·LNaCl溶液的目的是__________________•(4) 图C所示加入蒸馏水的目的是______________•(5) 为鉴定实验所得丝状物的主要成分是DNA，可用__________试剂进行检验，颜色反应为________色答案答案（（1 1））DNA DNA （（2 2）使血细胞吸水涨破，释放出核物质）使血细胞吸水涨破，释放出核物质DNADNA （（3 3）使）使DNADNA溶解于溶解于NaClNaCl溶液中溶液中（（4 4）使）使DNADNA的溶解度下降而析出的溶解度下降而析出 （（5 5）二苯胺）二苯胺 蓝色蓝色9 9、填写本实验完成下列实验操作时所用、填写本实验完成下列实验操作时所用试剂⑴ ⑴ 提取鸡血细胞中核物质提取鸡血细胞中核物质 ⑵ ⑵ 溶解核内溶解核内DNADNA：： ⑶ ⑶ 析出析出2mol/LNaCl2mol/LNaCl溶液中的溶液中的DNADNA ⑷ ⑷ 提取杂质较少的提取杂质较少的DNADNA白色乳状丝状物白色乳状丝状物 ⑸ DNA⑸ DNA的鉴定的鉴定 答案答案⑴⑴蒸馏水蒸馏水⑵2mol/LNaCl⑵2mol/LNaCl溶液溶液⑶⑶蒸馏水蒸馏水⑷⑷冷却的冷却的95%95%的酒精的酒精⑸⑸二苯胺二苯胺。