POD 测定方法.doc

植物体POD的测定※<原理>了解过氧化氢酶活性测定的几种方法，掌握用愈创木酚法分别测定过氧化氢酶和过氧化物酶的活性过氧化物酶广泛颁布于植物的各个组织器官中在有过氧化氢存在下，过氧化物酶能使愈创木酚氧化，生成茶褐色物质，可用分光光度计测量生成物的含量※<实验材料、试剂与仪器设备>1、实验仪器　722型分光光度计、离心机、秒表、电子天平、研钵2、实验试剂　愈创木酚、30%过氧化氢、20mmol/LKH2PO4、100mmol/L磷酸缓冲液(pH6.0)、反应混合液［100mmol/L磷酸缓冲液(pH6.0)50mL，加入愈创木酚28uL，加热搅拌，直至愈创木酚溶解，待溶液冷却后，加入30%过氧化氢19uL，混合均匀保存于冰箱中］3、实验材料　任何植物材料※<实验步骤>1、粗酶液的提取　称取植物(小麦叶片)材料0.1g，加20mmol/LKH2PO4 5mL，于研钵中研磨成匀浆，以10000r/min离心10分钟，收集上清液保存在冷处，所得残渣再用20mmol/LKH2PO45mL溶液提取一次，全并两次上清液2、酶活性的测定　取比色皿2只，于一只中加入反应混合液3mL，KH2PO41mL，作为校零对照，另一只中加入反应混合液3mL，上述酶液1mL(如酶活性过高可适当稀释)，立即开启秒表，于分光光度计470nm波长下测量OD值，每隔30s读数一次。

以每分钟表示酶活性大小，即以△OD470/min.mg蛋白质表示，蛋白质含量测定按Folin法进行※<结果计算>以每分钟吸光度变化值表示酶活性大小，即以ΔA470/[min.g(鲜重)]表示之也可以用每min内A470变化0.01为1个过氧化物酶活性单位(u)表示 过氧化物酶活性[u/(g.min)]=式中：ΔA470——反应时间内吸光度的变化 W——植物鲜重，g VT ——提取酶液总体积，mLVs ——测定时取用酶液体积 ,mL t——反应时间，min 项目详细信息介绍项目名称 过氧化物酶(POD)活性的测定（比色法）所属实验课程植物生理学实验学年度2007-2008学期01专业分类生物化学关键词过氧化物酶(POD)活性的测定实验要求选修带课教师陈颖实验目的过氧化物酶广泛分布于植物的各个组织器官中在有过氧化氢存在下，过氧化物酶能使愈创木酚氧化，生成茶褐色物质，可用分光度计测量生成物的含量基本描述1．称取植物材料1g，加入，0.1mo1/L磷酸缓冲 (pH7.0) 10ml(分三次加入，最后两次用于洗研钵)，在研钵中研磨成匀浆，以 4 000r／min 离心15分钟，倾出上清液 2．取一试管加 3.8 ml 0.3%愈创木酚反应液，加100ul 3％过氧化氢，加酶液100ul （视酶活性大小而定，如酶浓度高可稀释后再测定），摇匀，立即在分光光度计470nm下测吸光度，从加入酶液时立即开启秒表记录时间，1分钟时读数一次（也可2min，视材料而定）。

3．以每分钟吸光度变化值表示酶活性大小，即以△A470/min.mg蛋白质（或鲜重g）表示之过氧化物酶活性(U)=△A470/min×稀释倍数/g.Fw 该实验涉及到的主要仪器设备null实验总人数30每组人数4实验学时2是否特色否实验地点植物生理学实验室3.POD的测定方法试剂配制：（1）0.1mol/L的醋酸缓冲液：8.8mlA+41.2mlB得到100mlph5.4的醋酸缓冲液 A(0.2mmol/L的HAc溶液)—6ml冰醋酸溶到494ml蒸馏水中 B(0.2mmol/L的NaAc溶液)—13.6gNaAc.3H2O（2）0.25%愈创木酚溶液—125um愈创木酚溶于50ml 50%乙醇中（临用前配制）（3）0.75%H2O2溶液：1.25ml 30% H2O2定容至50ml（临用前配制）方法：比色杯中依次加入2ml 0.1mol/L的醋酸缓冲液—1ml 0.25%愈创木酚溶液—xml酶液（5min值为500-800即可）—0.1ml 0.75%H2O2溶液—迅速巅到混匀把A460调零并开始计时—1次/30s,连续读取3min过氧化物酶(POD)活性的测定【实验原理】植物体内的黄素氧化酶类代谢产物常包含H202 ，如光呼吸中的乙醇酸氧化酶、呼吸作用中 的葡萄糖氧化酶等。

H202的积累可导致破坏性的氧化作用过氧化氢酶(CAT)、过氧化物酶(POD)是清除H202的重要保护酶，能将H202分解为02和H20,从而使机体免受H202的毒害作用其活性与植物的抗逆性密切相关CAT)催化如下反应：2 H202→2 H20+ 02本实验通过测定H202的减少量来测定CAT的活性在H202存在条件下，过氧化物酶能使愈创木酚氧化，生成茶褐色的4-邻甲氧基苯酚可用分光光度计测生成物的含量来测定活性试剂药品1.50m mol/l pH7.0的磷酸缓冲液2.0.3% H202: 吸0.5ml 30% H202 加入pH7.0的磷酸缓冲液至 50ml3.0.2% 愈创木酚 :秤0.2g愈创木酚加入pH7.0的磷酸缓冲液至 100ml【实验步骤】酶液的制备1.称取叶片 0.25g ，加入5倍量的（M/V）pH7.0 的PBS 冰浴研磨 15000r/min离心15min取部分上清液经适当稀释后用于酶活性测定2. CAT活性的测定在3ml的反应体系中，包括0.3% H202 1ml, H20 1.95ml, 最后加入0.05ml酶液启动反应，测定波长240nm处的OD降低速度将每分钟OD减少0.01定义为1个活力单位。

3. POD活性的测定在3ml的反应体系中，包括0.3% H202 1ml, .0.2% 愈创木酚0.95ml,pH7.0的PBS 1ml，最后加入0.05ml酶液启动反应，记录470nm处OD增加速度将每分钟OD增加0.01定义为1个活力单位4. 用考马斯亮蓝 G-250法测定蛋白含量.【实验结果及计算】CAT和POD的酶活性以U/mg蛋白或U/gFW表示 （注：文档可能无法思考全面，请浏览后下载，供参考可复制、编制，期待你的好评与关注！）。