新型蒽醌类银离子荧光探针的合成、细胞成像和密度泛函理论研究.docx

新型蒽醌类银离子荧光探针的合成、细胞成像和密度泛函理论研究 毕晶晶 李琳琳 麻娜娜 夏丁丁 仉华 张志国 刘统信 张贵生摘要设计并合成了两个对称的1，2，3-三氮唑类蒽醌衍生物K1、K2， 采用1H NMR、13C NMR和HRMS表征其结构， 并考察了光谱性质利用GaussView 9.0量化程序及含时密度泛函TD-DFT方法对K1及K1-Ag+的结构性质及理论光谱进行了计算结果表明， 计算与测得的紫外-可见吸收光谱一致， 在370 nm左右出现蒽醌的吸收峰;荧光光谱表征实验表明，探针K1与Ag+结合后，出现两个吸收峰（466和522 nm），466 nm处荧光强度与单独K1相比增强9倍; 探针K1在H2O-DMSO （7∶1， V/V， HEPES， pH=7.4）中对Ag+具有良好的选择性识别性能， 常见共存离子及pH值对其测定无明显影响，通过Jobs plot 曲线确定二者之间的结合比为1∶1，结合常数为1368 L/mol，检出限为21.2 μmol/L（S/N=3）利用DFT方法对探针K1结构和K1-Ag+可能的络合结构进行了分子构型优化， 并计算络合物中Ag+与K1的结合能，结果表明，Ag+与两个三氮唑环和蒽醌单元络合结构结合能最大，与核磁滴定实验的结果吻合。

K1和K1-Ag+的优化结构显示，K1与Ag+结合后，分子的三氮唑环发生转位， 蒽醌平面发生轻度弯曲荧光共聚焦成像结果表明， 探针K1对Ag+有较好的选择性和灵敏度，可实现人肝癌细胞（HepG2）中微量Ag+的检测关键词蒽醌;三氮唑;荧光探针;银离子;荧光成像1引 言银离子（Ag+）具有杀菌、催化等特性[1，2]， 可作为抗生剂、动植物的转录抑制剂、耐质粒转变靶标等[3，4];同时，银在电子产品、摄影、影像、制药、医疗和生物学等领域应用广泛然而，这也造成了环境中的Ag+污染，威胁人类健康，引起了广泛关注如高浓度的Ag+可通过食物链在体内累积， 对大脑、神经和免疫系统等造成损害另外， 由于一些含银盐药物的过度及不合理使用， 也使Ag+积聚在肝脏组织，可引起肝癌等疾病[5～8]因此， 开发快速、灵敏的Ag+的分析检测方法具有重要意义目前，检测Ag+的方法包括荧光法[9，10]、电化学法[11]、比色法[12]、原子吸收法[13]和表面增强拉曼散射（SERS）[14]等其中荧光传感方法具有简单、成本低、快速、高选择性和灵敏度等特性， 广泛用于检测阳离子、阴离子等[15，16]近年来， 文献报道了许多检测重金属离子，如Zn2+、 Pb2+和Hg2+的新型荧光探针[17，18]， 以及检测Ag+的荧光探针， 如罗丹明、喹诺酮和BODIPY衍生物等[19，20]，然而，具有优良性能的Ag+荧光探针仍然是目前的研究热点。

蒽醌类衍生物，如阿霉素、柔红霉素等， 具有多种药理活性， 以及抗肿瘤、抗细菌、抗病毒、抗真菌、增强免疫力等多种生物学和药学特性[21]此外， 蒽醌类衍生物具有刚性平面结构， 并含有大环共轭体系， 具有荧光发射波长适中、光稳定性好、发光效率高的特点， 更主要的是其荧光和紫外吸收波长均出现在可见光区因此， 它还是一类重要的染料由于可以络合金屬离子， 氨基和羟基取代的蒽醌衍生物也被广泛用作发色团近年来，蒽醌类荧光探针逐渐成为科研人员关注的热点[22，23]，但蒽醌衍生物荧光探针用于Ag+检测的研究尚未见报道1，2，3-三氮唑化合物是一类具有重要生物活性的五元氮杂环化合物， 多数基于三氮唑基团的探针主要是通过三氮唑形成一个结合口袋， 当被分析物与探针逐渐结合后， 由于荧光机制不同，如PET （光诱导电子转移）、ICT （电荷转移）等， 探针的荧光或增强或淬灭， 因此，三氮唑基荧光探针通常具有良好的选择性和强的结合能力[24，25]本研究以具有优良生物学特性和光学特性的蒽醌为母体，设计合成了一类基于分子内电荷转移（ICT）可用于细胞成像的高选择性银离子荧光探针利用蒽醌作为荧光团， 以1，2，3-三氮唑为结合位点， 通过Click反应合成了含有不同羟烷基链的蒽醌衍生物K1和K2， 并利用DFT理论计算等手段研究了探针K1与Ag+的络合结构和光致发光的机理，实现了对Ag+的专一性、高灵敏性检测，并可用于生物成像检测。

2实验部分2.1仪器与试剂UV-2600紫外可见分光光度计 （日本岛津公司）;AC400 型超导核磁共振仪 （TMS作内标，瑞士布鲁克公司）;UPLC-TQD液相色谱-串联四极杆质谱仪 （美国沃特斯公司）;F-4500 荧光分光光度计 （日本日立公司）;FV 1000激光共焦显微镜 （日本奥林巴斯公司）葡萄糖、溴己醇、溴丙醇、叠氮化钠、五水硫酸铜、抗坏血酸钠（北京伊诺凯科技有限公司）;三氟化硼乙醚 （分析纯，百灵威科技有限公司）;1，8-二羟基蒽醌、溴丙炔 （上海达瑞精细化学品有限公司）;金属硝酸盐与硫酸盐为结晶水合物所用试剂均为分析纯;实验用水为二次亚沸蒸馏水2.2荧光探针K1和K2的合成银离子荧光探针K1和K2的合成路线：2.2.11，8-二-O-炔丙基-蒽醌2的合成[26] 将1，8-二羟基蒽醌 （2.013 g， 8.38 mmol）溶于100 mL N，N-二甲基甲酰胺（DMF）中， 加入K2CO3 （5.96 g， 42 mmol） 和3-溴-1-丙炔 （2.6 mL， 33.5 mmol）， 室温搅拌反应20 h后， 用二氯甲烷萃取，水洗涤，无水Na2SO4干燥， 过滤并浓缩， 用柱层析 （石油醚-乙酸乙酯，4∶1，V/V） 分离得到2.330 g黄色固体1，8-二-O-炔丙基-蒽醌2， 产率为88%。

1H NMR （400 MHz， CDCl3）： δ 7.92 （dd， J=8.0， 0.8 Hz， 2H）， 7.67 （t， J=8.0 Hz， 2H）， 7.50 （dd， J=8.4， 0.8 Hz， 2H）， 4.94 （d， J=2.4 Hz， 4H）， 2.55 （t， J=2.4 Hz， 2H）2.2.2化合物 3a和3b的合成[27] 将1-溴丙醇 （2 mL， 22.3 mmol， 1.0 equiv） 溶于20 mL DMF中， 加入叠氮化钠（4.34 g， 66.9 mmol， 3.0 equiv）， 90 oC 加热搅拌薄层色谱（TLC）监测原料反应完全后， 加入水，用二氯甲烷萃取，旋转蒸干有机相， 柱色谱分离，得到无色油状液体 1-叠氮基丙醇3a （2.1962 g， 97%）采用同样方法制得无色油状液体 1-叠氮基己醇3b，产率为 85%3a： 1H NMR （400 MHz， CDCl3） δ 3.74～3.71 （m， 2H）， 3.43 （t， J = 6.8 Hz， 2H）， 1.85～1.78 （m， 2H） 3b： 1H NMR（400 MHz， CDCl3） δ 3.64 （t， J = 6.8 Hz， 2H）， 3.26 （t， J = 6.8 Hz， 2H）， 1.64～1.54（m， 4H）， 1.45～1.38 （m， 4H）。

2.2.3探针K1和探针K2的合成将1-叠氮基丙醇3a （0.40 mL， 6.08 mmol） 和1，8-二-O-炔丙基-蒽醌1（0.50 g， 1.58 mmol） 溶于H2O-THF（1∶1，V/V）混合溶剂中，加入CuSO45H2O（59 mg， 0.24 mmol）和L-抗坏血酸钠盐（90 mg， 0.48 mmol）， 避光，于55℃加热搅拌下反应，产物用二氯甲烷萃取，水洗涤， 无水Na2SO4干燥， 过滤、浓缩， 用柱色谱分离（乙酸乙酯-甲醇，10∶1，V/V） ，得到黄色固体化合物K1（150 mg， 80%）采用同样方法制备黄色固体化合物K2（产率为95%） Compound K1：1H NMR（400 MHz， DMSO-d6） δ 8.25（s， 2H）， 7.76～7.70（m， 6H）， 5.34（s， 4H）， 4.68（t， J=4.4 Hz， 2H）， 4.43（t， J=7.2 Hz， 4H）， 3.40（dd， J=10.8， 6.0 Hz， 4H）， 1.99～1.92（m， 4H）13C NMR（150 MHz， DMSO-d6） δ 183.2， 181.1， 157.5， 142.3， 134.2， 125.0， 123.9， 120.9， 118.8， 62.5， 57.4， 46.8， 33.0。

ESI（+）-HRMS（m/z）： [M+Na]+ calcd. for C26H26N6O6Na 541.1806， found 541.1802）Compound K2： 1H NMR（400 MHz， DMSO-d6） δ 8.23（s， 2H）， 7.75～7.70（m， 6H）， 5.34（s， 4H）， 4.37～4.32（m， 6H）， 3.36～3.32（m， 4H）， 1.83～1.76（m， 4H）， 1.40～1.32（m， 4H）， 1.30～1.67（m， 8H）13C NMR（100 MHz， DMSO）： δ 183.1， 181.0， 157.4， 142.3， 134.2， 124.6， 124.0， 121.0， 118.8， 62.6， 60.5， 49.4， 32.3， 29.8， 25.7， 24.9ESI（+）-HRMS（m/z）： [M+Na]+ calcd. for C32H38N6O6Na 625.2745， found 625.2745）2.3探针溶液的制备和检测方法配制浓度为1.0 102 mol/L的K1、K2探针DMSO储备溶液、浓度为1.0 103 mol/L的不同阳离子储备溶液以及pH=7.4 的HEPES（10 mmol/L）缓冲溶液。

测试前用HEPES缓冲溶液将上述储备液稀释到所需浓度，在5 mL比色管中分别加入600 μL DMSO、 25 μL K1标准液和适量金属离子标准液， 用HEPES缓冲溶液定容至5 mL， 摇匀， 静置30 min后，测量紫外-可见吸收光谱和和荧光光谱（λex=340 nmf， 激发狭缝10.0 nm， 发射狭缝20.0 nm， 仪器灵敏度为高）2.4细胞成像实验将复苏的人肝癌细胞HepG2（Human hepatoma cell line，中国医学科学院）用含10%胎牛血清的DMEM培养基， 在5% CO2、37℃条件下培养， 待其贴壁80%左右， 消化、离心、计数，接种到激光共聚焦皿中（50000个/皿）， 在5% CO2、37℃培养箱内培养12 h， 待其贴壁后进行实验用培养基稀释K1溶液至50 μmol/L，与贴壁后的细胞共培养30 min， 接着用PBS缓冲液洗涤细胞3次，进行共聚焦成像另外，将细胞与50 μmol/L Ag+溶液培养30 min，然后用探针染色30 min ， PBS缓冲液洗涤3次后，成像分析3结果与讨论3.1探针K1和K2对金属离子的识别采用紫外-可见吸收光谱和荧光光谱考察了探针K1和K2对不同离子的响应。

分别测定含有探针K1（50 μmol/L）和金属离子Ag+、Al3+、Ba2+、Ca2+、Cd2+、Co2+、Cr3+、Cu2+、Hg2+、Fe3+、K+、Mn2+、Na+、NH+4、Ni2+、Pb2+和Zn2+（1.0 mmol/L， 20 equiv.）的HEPES-DMSO（7∶1， V/V）溶液的紫外-可見吸收光谱和荧光光谱加入Ag+后，探针的紫外吸收峰从378 nm蓝移到364 nm处由荧光光谱可见， 未加入离子前， 探针K1在466和522 nm处的荧光峰强度很低;只有加入Ag+时的荧光强度明显增强， 而其它金属离子的加入对探针。