毕赤酵母表达系统.docx

毕赤酵母表达系统前言：所用表达质粒有pPIC3.5K,pAO815用于胞内表达，而pPIC9K用于分泌表达，所有载体均利 用AOX1启动子来诱导高水平表达抗性选择：最有效的筛选遗传霉素抗性及高抗性克隆的程序需要先对HIS +转化子进行选择，再 进行不同水平遗传霉素抗性筛选毕赤菌株表型：毕赤酵母菌GS115及KM71在组氨酸脱氢酶位点（His4）有突变，因而不能合成 组氨酸，所有表达质粒都有HIS4基因可与宿主进行互补，通过不含组氨酸的培养基来选择转化 子GS115及KM71都可在复合培养基如YPD （YEPD）及含组氨酸的最小培养基中生长转化 之前，GS115及KM71都不能在最小培养基中生长，因为它们是His-培养温度：毕赤酵母生长温度为28-30度（液体、平板、斜面）在32 度以上诱导生长时， 对蛋白表达有害，甚至会导致细胞死亡贮存：贮存细胞几周或几月，用YPD培养基或YPD琼脂斜面1挑取所需菌株单克隆在YPD平板上划线生长；2挑取单克隆转移至YPD进行穿刺培养，30度2 天；3 细胞在4 度可放几周几月或几年，存于－80度1挑取所需菌株单克隆在YPD中过夜培养；2收集细胞，在含15%甘油的YPD中悬浮至终 OD600为50-100（大约2.5-5.0X10g细胞/ml） ； 3细胞先用液氮或干冰/酒精浴中冰冻再贮存于-80 度。

注意：在4度或一80度长期保存后，用之前建议在MM、MD或MGY平板上划线培养以质粒pPIC9K，以检测His+转化子的表型是否正确及其活力酵母Pichia pastorGS115为例说明做法载体PPIC9K酶切为点线性化质粒DNA：建议使用下列方法线性化载体以获得Mut+及Muts重组子，可能其 中一个会比另一个更利于表达多拷贝重组子如果只想得到Muts重组子，使用KM71菌株 单个十字交换事件可比双重十字交换更容易、更有效地获得Muts重组菌（例如：插入AOX1 或his4而不是取代AOX1）如果插入片段含有下列任何限制性位点，见p29-30以替换位点1如果克隆进Ppic3.5k,线性化时，插入AOX1用SacI（GS115, Mut+或KM71, Muts）;插入HIS4用 SalI（GS115, Mut+ 或 KM71, Muts）2如果克隆进pAO815，线性化时，插入HIS4用Sall或Stul （GS115, Mut+或KM71, Muts）注意如果用pAO815载体，插入2个或更多拷贝子会产生SacI酶切位点3如果克隆进Ppic9k，线性化时，插入AOX1用SacI（GS115, Mut+或KM71, Muts）,插入HIS4用 SalI（GS115, Mut+ 或 KM71, Muts）。

一．毕赤酵母表达常用溶液及缓冲液的配制1．1 各种母液的配制10*YNB（含有硫酸铵、无氨基酸的13.4%酵母基础氮源培养基）4°C保存34g酵母基础氮源培 养基（无硫酸铵）+100g硫酸铵，溶于1000ml水中，过滤除菌500*B（0.02%生物素Biotin）4C保存20mg的生物素溶于100ml水中，过滤除菌 100*H（0.4%Histidine组氨酸）4C保存400mg的L-组氨酸溶于100ml水中，（加热至50C以促 进溶解），过滤除菌10*D（20%Dextrose葡萄糖）200g葡萄糖溶于1000ml水中，灭菌15m in或过滤除菌10*M(5%Methanol甲醇)保存期为2个月将5ml的甲醇与95ml水混匀，过滤除菌10*GY(10%Glycero咁油)将100ml甘油和900ml水混匀后，高压灭菌或过滤除菌 100*AA(0.5% of each Amino Acid,各种氨基酸)4°C保存分别将500mg的L-谷氨酸、L-蛋氨 酸、L-赖氨酸、L-亮氨酸和L-异亮氨酸溶于100ml水中，过滤除菌1M 磷酸钾溶液(potassium phosphate buffer, pH6.0),将 1mol/L的K2HPO4溶液 132ml与 1mol/L的KH2PO4溶液868ml混匀，其pH为6.0,如需调节pH,则使用磷酸和氢氧化钾调节pH。

1.2 常用溶液及缓冲夜1.2.1碱裂解法抽提质粒DNA所用溶液：溶液I： 50mmol / L glucose， 100mmol / L EDTA， 25mmol / L Tris—HCI (pH 8.0)溶液 II： 0.2mol / L NaOH，1% SDS (临用时配制)溶液III： 29.44g KAc，11.5ml Acetic acid,加口ddH2O至 100 ml4C保存1.2.2 10% 甘油 (Glycerol)：将100ml甘油和900ml水混匀后，高压灭菌或过滤除菌保存期为1年以上1.2.3 Rnase-H2O： 1ul Rnase 加入 1ml 灭菌 dd H2O4C保存1.2.4 TE缓冲液：10mmol / Tris-CI (pH 8. 0), lmmol / L EDTA (pH 8.0)1.2.5 STE缓冲液：0.1mol / L, 10mmol / L Tris-HCl (pH 8.0), 1mmol / L EDTA (pH 8.0)1.2.6 SCE缓冲液：1mol / L Sorbitol (山梨醇),10mmol / L 柠檬酸钠，10mmol / L EDTA1.2.7 1M potassium phosphate buffer(pH 6.0)： 132 ml 1M K2HPO4,868 ml 1M KH2PO4.1.2.8 50X TAE 琼脂糖凝胶电泳缓冲液，pH 8.0 (1L)： 242 g Tris,57.1 ml Acetic Acid, 37.2 g EDTA二.毕赤酵母表达的培养基配制[5]2.1 LB (Luria—Bertani)培养基：Trypton l%,Yeast Extract 0.5%, NaCl l%, PH 7.0制作平板时加入2%琼脂粉。

121C高压灭菌20min可于室温保存用于培养pPICZa A 原核宿主菌TOP10F '时可加入Zeocin 25ug /ml2.2 LLB (Low Salt LB)培养基：Trypton l%, Yeast Extract 0.5%, NaCl 0.5%, PH 7.0制作平板时加入2%琼脂粉121C高压灭菌20min可于室温保存数月用于培养pPICZ a A原核宿主菌TOP10F'时，加入Zeocin 25ug / ml,可以4C条件下保存1〜2周2.3 YPD (又称YEPD) Yeast Extract Peptone Dextrose Medium, (Yeast Extract Peptone Dextrose Mediu m,酵母浸出粉/胰蛋白胨/右旋葡萄糖培养基)：Trypton 2%, dextrose (glucose) 2% +agar 2%, +Zeocin 100 yg/ml液体YPD培养基可常温保存；琼脂YPD平板在4C可保存几个月加入Zeocin 100ug / ml,成 为YPDZ培养基，可以4C条件下保存1〜2周2.4 YPDS + Zeocin 培养基(Yeast Extract Peptone Dextrose Medium):yeast extract 1%, peptone 2%, dextrose (glucose) 2%, sorbitol 1 M+agar 2%+ Zeocin 100 yg/ml 不管是液体YPDS培养基还是YPDS + Zeocin培养基，都必须存放4C条件下，有效期1〜2周。

2.5 MGY: Minimal Glycerol Medium (最小甘油培养基)(34%YNB； 1%甘油；4*10-5%生物素)将800ml灭菌水、100ml的 10*YNB母液、2ml的500*B 母液和100ml的10*GY母液混匀即可，4C保存，保存期为2个月2.6 MGYH: Minimal Glycerol Medium + Histidine (最小甘油培养基 + 0.004%组氨酸) 在1000ml的MGY培养基中加入10ml的100*H母液混匀，4C保存，保存期为2个月2.7 RD: Regeneration Dextrose Medium (葡萄糖再生培养基)(含有：1mol/L的山梨醇；2%葡萄糖；1.34%YNB； 4*10-5%生物素；0.005%氨基酸)1. 将186g的山梨醇定容至700ml,高压灭菌；2. 冷却后于45C水浴；3.将 100ml的 10*D、100ml的 10*YNB； 2ml的500*B； 10ml的 100*AA等母液和88ml无菌水混 匀，预热至45°C后，与步骤2的山梨醇溶液混合4°C保存2.8 RDH: Regeneration Dextrose Medium + Histidine （葡萄糖再生培养基 + 0.004%组氨酸） 在RD培养基配制的第三步中，在加入10m l的100*H母液，同时无菌水的体积减少至78 ml即 可，其余配制方法与RD相同。

4°C保存2.9 RD及RDH平板的制备1. 将186g的山梨醇和15-20g琼脂粉定容至700ml，高压灭菌；冷却后于60C水浴；2. 参照RD/RDH液体培养基配制的步骤4,将100ml的10*D、100ml的10*YNB； 2ml的500*B； 10ml的100*AA等母液、（10ml的100*H母液）和88 （78） ml无菌水混匀，预热至45C后，与 步骤1的山梨醇/琼脂液混匀；3. 迅速制备平板4C可保存数月2.10 RD及RDH的TOP琼脂的制备（常用于酵母菌的包被）1•将186g的山梨醇和7.5〜10g琼脂粉定容至700ml，高压灭菌；冷却后于60C水浴；2. 参照RD/RDH液体培养基配制的步骤4,将100ml的10*D、100ml的10*YNB； 2ml的500*B； 10ml的100*AA等母液、（10ml的100*H母液）和88 （78） ml无菌水混匀，预热至45C后，与 步骤1的山梨醇/琼脂液混匀；3. 将该TOP琼脂置于45°C水浴冷却、保温，备用2.11 MD 与 MDH: Minimal Dextrose Medium +（Histidine）最小葡萄糖培养基+（0.004 %组氨酸） （含有：1.34%YNB；； 4*10-5%生物素；2%葡萄糖）1. 100ml的10*YNB； 2ml的500*B和100ml10*D母液，用800ml的无菌水定容至1000ml即可；2. 如配制MDH，可在上述的MD中加入10ml的100*H即可；3. 如配制平板，可无菌水的灭菌前，加入15~20g的琼脂。

4°C可保存数月2.12 SOC培养基：Trypton l%, Yeast Extract 0.5%, NaCl 0.05%, Glucose （1mol / L） 2%, 121C 高压灭菌20min，冷却后，4°C保存三．主要试验环节的操作3.1酵母菌株的分离纯化：接种GS115于5ml YPD液体培养基，30C，200rpm振荡过夜，涂 布YPD平板，30C培养48小时，用YNB基本培养基和含His的补充培养基作点种分离纯化, 挑选在补充培养基上生长而在基本培养基上不生长的单菌落划YPD平板，4°C保存3.2 pPICZaA原核宿主菌TOP10F'的活化培养TOP10F'做菌种保存在一70C条件下，在进行扩 大培养抽。