琼脂糖凝胶电泳的制备及核酸检测.docx

实验二 琼脂糖凝胶电泳的制备及核酸检测一. 实验目的1、掌握琼脂糖凝胶电泳的原理;2、学习琼脂糖凝胶电泳的操作二、实验原理溴化乙锭（EB）为扁平状分子，在紫外照射下发射荧光EB可与DNA分子 形成EB-DNA复合物，其发射的荧光强度较游离状态EB发射的荧光强度大10倍 以上，且荧光强度与DNA的含量成正比用肉眼观察，可检测到5 ng以上的DNA1. 影响DNA在琼脂糖凝胶中迁移速率的因素：1）DNA分子大小迁移速率U与logN成反比（N为碱基对数目）分子大小相等，电荷基本相等 （DNA结构重复性）分子越大，迁移越慢等量的空间结构紧密的电泳快（超 螺旋〉线性DNA）2） 琼脂糖浓度：不同的凝胶浓度，分辨不同范围的DNAAgarose： 0.5%： 1-30 kb；0.7%： 0.8-12 kb1.2%： 0.4-7 kb；1.5%： 0.2-3 kb.3） DNA构象：一般迁移速率超螺旋环状〉线状DNA＞单链开环4） 所加电压：低电压时，线状DNA片段的迁移速率与所加电压成正比使分辨效 果好，凝胶上所加电压不应超过5V/cm5） 碱基组成与温度：一般影响不大4 -30 °C6） 嵌入染料的存在：降低线性DNA迁移率，（不提倡加在电泳液中）7） 电泳缓冲液的组成及其离子强度影响DNA的迁移率，无离子存在时，核酸基本 不泳动，离子强度过大产热厉害，熔化凝胶并导致DNA变性，一般采用1XTAE， 1XTBE，1XTPE（均含 EDTA pH8.0）。

2. 溴化乙锭（EB）为致癌剂，操作时应戴手套，尽量减少台面污染3. 电泳指示剂：核酸电泳常用的指示剂有两种，溴酚蓝呈蓝紫色；二甲苯晴呈 蓝色，它携带的电荷量比溴酚蓝少，在凝胶中的的迁移率比溴酚蓝慢4. 电泳缓冲液：TAE TBETAE与TBE不同之处在于TBE用硼酸代替了 TAE中的冰醋酸三、 仪器和试剂仪器微量移液器，电泳仪，电泳槽，微波炉 试剂琼脂糖：1.0%；电泳缓冲液（50 X TAE电泳缓冲液取Tris24.2g，冰醋酸5.7ml， 0.25mol/L EDTA （pH8.0）20ml，加蒸馏水至 100ml ）EB 5 m / 100 ml TBE电泳材料：标准分子量核酸（DL2000）四、 操作步骤（1）制胶（以20 mL为例）a. 称取0.2 g琼脂糖，加入20 ml的TAE缓冲液（pH 8.0），摇匀；b. 微波炉加热，至琼脂糖完全溶解（要防止过热溢出三角瓶）；c. 将制胶板放入制胶槽中，插入适当的梳子，将溶解的琼脂糖(约50°C )加 入2ul EB后，混均匀，倒入其中，直至厚度为4〜6 mm (如有气泡要把气泡赶 出) ，在室温下冷却凝固(约30~ 45 min)；d. 将制胶板置于电泳槽中，小心垂直向上拔出梳子，以保证点样孔完好。

2) 点样用微量移液器将5 M含蓝色染液的DL2000加入点样孔下部3) 电泳打开电源开关，调节电压至3~5V/cm(约100 V)，可见到溴酚蓝条带由负极 向正极移动，约30-40分钟后即可观察结果4) 观察 将电泳好的胶置于紫外透射检测仪上，打开紫外灯，可见到橙红色核酸条带，根 据条带粗细，可粗略估计该样品DNA的浓度如同时有已知分子量的标准DNA 进行电泳，则可通过线性DNA条带的相对位置初步估计样品的分子量五、 实验结果与分析1、 有条带跑完电泳后两边淡，中间较粗，很可能是由于点样时不均匀，两边点 样较少；2、 有条带跑完电泳后看不见，很可能是由于样品未加入点样孔，飘浮在电泳液 里了六、 思考题 做琼脂糖凝胶电泳应注意哪些问题？1、加样时枪头不要碰坏凝胶壁，否则DNA的带型将不会整齐，加样前要用枪头 吸打凝胶孔中的溶液，以赶走样品空中的气泡2、应注意每孔最大上样容量及 样品孔体积，以免加样时样品流入附近样品孔造成交叉污染，影响结果分析 3．配琼脂糖时应使其完全熔化后方可制胶4．琼脂糖凝胶易于破碎，操作时要轻缓 5．电泳时应注意电源线路，预防触电6．溴化乙淀具有致癌作用，配制及使用时应带乳胶或一次性塑料手套。

并在专 门的实验室内使用7．紫外线对人体有损伤作用，开灯时间不宜太长，注意防护。