临床微生物学实验手册.docx

临床微生物学试验手册前 言临床微生物学试验须知— 试验规章临床微生物学试验的对象大多为致病性微生物，工作中常常使用电源和易燃物品，为了防止发生试验室感染与火灾、烧伤、触电等意外事故外，必需严格遵守以下规章1 进试验室应穿工作服，只带必要的文具和讲义等 2 试验室内保持安静、干净，制止饮食、吸烟和开玩笑试验时严峻认真、集中精力完成 试验操作，操作过程中，不应谈话，不旁视，养成在室内手不触及口腔、头发及身体的习惯， 长头发者诮将头发向后扎紧或戴工作帽，以防头发被污染或烧焦3 发生操作事故，工作环境被带菌材料污染，马上报告教师进展处理4 试验用过的带菌材料(如吸管、玻片等)必需马上放在指定的消毒缸内，不得放置试验台上待消毒或废弃物品放在指定地点试验室内任何物品不得带出室外5 试验完毕时，必需整理清洁试验台和试验室，关好水、电、门窗等6 离室前应用肥皂和水洗手，并用消毒剂擦手二 试验课的根本要求1 试验前必需认真做好预习，教师将检查预习状况2 试验时严格遵守试验规章，认真做好每个试验3 试验后必需按本人所得试验结果照实写出试验报告，并通过复习有关理论学问，对自己的试验结果作出分析和解释4 试验课是本门课程的重要内容，教师将依据试验课表现，试验结果、试验报告及试验考核评定成绩，并作为总成绩的重要组成局部。

10第一章 临床细菌学根本技术第一节 一般光学显微镜显微镜的光学原理、使用方法和保养详见有关教材其次节 形态学检查技术1.2.1 不染色细菌标本的检查法不染色的细菌标本的镜检，虽可观看细菌的大小、形态，但主要用于观看细菌的动力〔一〕 悬滴法【操作方法】1 取凹玻片，于凹窝内四周涂凡士林(可浆糊)少许2 在盖玻片中心放一接种环细菌的肉汤培育物3 将凹玻片反转，使凹窝对准盖玻片中心并盖于其上，然后翻转玻片，以小镊子或接种环柄轻加压力，使盖玻片与凹窝边缘沾紧如无凹玻片时，亦可在载玻片之适当位置上加凡士林，其中垫以其他物体，然后使盖玻片重叠于玻片之上4 将制好的悬滴标本置于显微镜载物台中心，先以低倍镜找到悬滴的边缘以后，将集光器下降缩小光圈，再换高倍镜观看结果】有鞭毛的细菌为真正运动，无鞭毛的细菌则为布朗运动用途】用以观看的形态及动力〔二〕 悬滴法【操作方法】1 用接种环取菌液〔或将少许固体培育物悬于一滴生理盐水中〕2-3 环置于载玻片中心2 用镊子夹好盖玻片、掩盖开菌液上，在放置时，先将盖玻片一边接触菌液，缓缓放一， 以不产生气泡为泡佳3 先以低倍镜找好位置，再以高倍镜观看结果】与悬滴法一样。

用途】用以观看细菌的形态及运动，本法较悬滴法简洁，但标本简洁枯槁，不易长时间观看1.2.2 细菌染色的根本步骤1 涂片1.1 于干净无油脂载玻片中心加一滴生理盐水1.2 用经火灭菌的接种环挑取标本少许，放在生理盐水滴内研匀涂成菲薄的菌膜，假设为液体标本，直接挑取少许涂抹即可1.3 假设为多标本而行用一染色时，可事先用蜡笔在玻片上划为数格，并于玻片的反面标明标本编号2 枯燥 一般在室温中待其自然枯燥，假设须加速枯燥，可在火焰上方的热空气中加温枯燥， 但切勿紧靠火焰，以防标本烤枯，不堪检视3 固定 固定的目的主要使细菌的细胞质凝固，杀死细菌，使菌体与玻片粘附得较牢， 以及转变菌体对梁料的通透性，通常用加热法，马上涂片快速通过火焰2-3 次，以玻片反面触及皮肤，热而不烫为度4 染色 将涂片置染色架上，滴加染液以掩盖标本为度5 媒染 主要是增加菌体与染液间的作用力，其方法有用热、金属盐、碘等6 脱色 目的在于测知染料与被染物之间结合的结实程度，起鉴别鉴别细菌的作用，将脱色剂〔例如酒精和酸等〕滴加于经过染色的标本上，作用确定时间后除去脱色剂7 复染 目的在于使已脱色的菌体重染色与前染液颜色呈明显比照之颜色。

8 染色标本的保存与卦片法，观看细菌染色标本均用油浸镜如需要保存标本，可于观看 后，拭镜纸沾二甲苯轻轻将镜油擦去即可，假设长期保存，最好于标本中心滴一滴加拿大树胶， 上掩盖一干净载盖片待其自然枯燥后，保存于玻片盒内，可多年不变色1.2.3 革兰氏染色法【染色液】1 结晶紫溶液 称取结晶紫 4-8g，溶于 95%酒精 100ml 中，制成饱和液，再取饱和液 20ml 与 10g/L 的草酸铵溶液 80ml 混合即成2 卢戈氏碘液 先溶碘化钾 2g 于 10ml 蒸馏水中，再加碘1g，待碘全部溶解后，加蒸馏水200ml 即成3 脱色剂(1) 95%酒精(2) 丙酮乙醇溶液(95%乙醇 70ml 加丙酮 30ml)此两种脱色剂均可应用，但混合脱色剂比单用 95%酒精好，易于把握，反响准确4 复染液(1) 稀释石炭酸复红液：取萋-尼二氏抗酸染色液中的石炭酸复红液(碱性复红酒精饱和液10ml 与 5%石炭酸 90ml 混合)10ml 参与蒸馏水 90ml 即成2) 沙黄溶液(25g/L 的沙黄乙醇溶液 10ml 加蒸馏水 90ml)操作方法】1 将结晶紫染液滴加在已固定的涂片上，染1min 后水洗。

2 加卢戈氏碘液适量，染 1min 后水洗3 用 95%酒精脱色，摇动玻片至紫色不再为酒精脱落为止(依据涂片上之厚薄约需0.5-1min) 后水洗4 用稀释石炭酸复红染 30S 至 1min5 用水冲洗，待干，镜检结果】 革兰氏阳性菌染成紫色，革兰氏阴性菌染成红色留意事项】配制的染液应先用的革兰氏阳性菌和阴性菌〔通常用金黄色葡萄球菌与大肠杆菌的16 小时培育物〕进展比照试验以检查染色液的质量是否适用结晶紫与草酸铵溶液混合后不能保存太久如有沉淀消灭，应重配制使用第三节 高压蒸汽灭菌技术高压蒸汽灭菌法是细菌室对试验室材料进展灭菌的主要手段主要设备是蒸汽高压锅有卧式和立式两类此外还有手提式小型高压锅，使用比较便利高压灭菌的原理是利用增加锅内蒸汽的压力而提高蒸汽温度，到达全部杀灭微生物的作用压力与温度的关系见表 1－3－1压 力公斤/CM磅0.3551080.70101161.05151211.4020127温度〔℃〕表 1—3—1 压力与温度的关系现在最常用的培育基灭菌条件是15 磅15 分钟，时间过长有可能破坏培育基的养分成分含糖的生化培育基的灭菌条件是 10 磅 15 分钟，或用流淌蒸汽法灭菌。

器皿的灭菌可以 15 磅 20 分钟高压灭菌操作方法如下：欲灭菌物品放入锅内，关闭锅门，拧紧螺丝确认已经密闭，可进展下一步操作翻开排气阀开蒸汽开关，向锅内送蒸汽或电源，使产生蒸汽观看排气阀的排气状况，待排出的气体由冷空气变为蒸汽，温度为105℃时，可关闭排气阀高压灭菌时须留意，必需待锅内冷气完全排出后才可关闭排气阀加压，不然达不到灭菌效果有数据说明，在 15 磅含有 40%空气的温度约为 105℃由此可见，假设锅内残留有冷空气，即使压力到达 15 磅，温度也达不到 121℃，不能杀灭微生物观看压力表升至 15 磅时，开头记住压力到达 15 磅后，可调整进气阀，削减进气量维持压力稳定在15〔1 公斤/c ㎡〕磅电加热时，可以断和接通电源、维持压力持续15 分钟，至少不能超过30 分钟，否则养分物破坏关掉进气阀门或切断电源，让锅内物品自然冷却，不行马上翻开排气阀，以免发生意外待锅内压力降为零时，才可以翻开锅门，取出物品灭菌培育基时，必需准时翻开锅盖，不然培育基的颜色回变深第四节 培育基制备技术传统的制备培育基方法是在试验室内由自己配制但现在越来越多的试验室使用成品枯燥培育基由于成品培育基由生产厂统一购制原料生产。

假设有较好的产品质量保证，质量是牢靠的使用枯燥培育基有不少优点，但使用时还有些技术问题应当留意1) 溶化 配制的培育基必需在玻璃器中进展如用铜、铁器器皿，会影响细菌生长一般先将需要的蒸馏水按定量参与容器中，然后称取确定量培育基干粉，放入水中，静置 10— 20 分钟除琼脂外，一般成分均可自然溶解留意不行先加干粉后加水，这不利于溶解搅拌或振荡器皿后或延长放置时间以促进溶解只有不得已〔或需要〕的状况下加热溶解但加热时间不宜过长温度不宜过高因高热对琼脂及某些养分成分有破坏作用2) 调整 pH：商品枯燥培育基一般已校正 PH 用时须再验证常用的分别培育基 PH 为 7.2—7.4高压灭菌前，可用PH 计校正由于高压灭菌可影响PH，所以验证 PH 还应在高压灭菌后进展最简便的方法是用周密 PH 试纸插入起倾制好的琼脂平板或分装试管的液体培育基中，推断是否符合要求3) 分装：液体培育基一般在灭菌前分装，分装是应留意每管的分装量不应高于试管的2/3在灭菌后，还要参与成分的液体培育基及半固体培育基，要在高压灭菌后分装琼脂平板是在培育基高压灭菌之后制备，应等培育基冷至 50—60℃再倾平板，否则水蒸汽多。

参与培育基中的血液假设保存在冰箱，用前应提前取出暖至室温后，再加到培育基中一般倒在玻璃平皿中的琼脂平板在无菌室中放置3—4 小时或过夜，平皿内的水蒸汽会自然蒸发假设用塑料平皿，因密闭较严，须在35℃培育基中烘烤 30—60 分钟方法是将平板放入卵箱，正面对下以防细菌落入而污染卵箱门不要关严应留一点缝隙，使水蒸气排到箱外用这种烤法要定时检查以免烤干琼脂平板放4℃冰箱保存4) 质量检查(1) 无菌试验：可将制好的培育基在 35℃卵育过夜，判定是否灭菌合格另一种简便的方法是制作的平板在无菌室放置室温〔20℃—30℃〕过夜一方面可使水蒸气干，另一方面可以推断是否有污染2) 效果检验：按不同的培育基要求接种相应的菌株观看细菌的发育、菌落形态、色素溶血等特征，推断培育基是否符合要求5) 保存：液体培育基如无特别要求可在室温中保存，两周内用完过于枯燥的地区应缩短保存期琼脂平板须在4℃保存，一般不超过4 天如用塑料袋密封，保存期可延长，但至多两周保存的培育基是否能用，须视培育基中水份蒸发程度及有无污染而定第五节 指示剂的配置技术指示剂一般是加在培育基中，来指示细菌代谢后培育基PH 的变化常用指示剂如见表1—5—1。

指示剂PH 范围酸色—碱色甲基红4.2—6.2红—黄溴甲酚紫5.2—6.8黄—紫溴麝香草酚兰6.0—7.6黄—兰酚红6.8—8.7黄—红中性红表 1-5-16.8—8.0常用指示剂的变色性红—黄配置指示剂用的溶剂有两种：乙醇和蒸馏水两种溶液各有不同用途，使用时应留意指示剂的乙醇溶液多用于培育基的PH 滴定由于指示剂在乙醇中溶解度较大，所以在需制备高浓度溶液时用乙醇作为溶剂制备生化反响培育基，要慎用乙醇做溶剂由于某些细菌可以利用乙醇进展代谢，产生酸性反响假设用乙醇液的指示剂制备发酵培育基，将会影响试验结果的牢靠性所以，制备生化培育基以水溶液为佳指示剂的水溶液往往不易完全溶解，实际上是混悬液此液可用来制备培育基，但应留意在取液前，必需充分摇匀，以保证取量正确每种指示剂的具体配制浓度见各有关局部配制指示剂的一般步骤：1. 称确定量指示剂化学品。