人类染色体G带制备.docx

人类染色体G带标本制备及观察一、实验目的和要求初步掌握人类染色体标本培养制备的基本方法初步掌握人类染色体G显带标本制备的方法及各号染色体G带带型二、实验内容和原理正常情况下，外周血中的小淋巴细胞，几乎都处在G1期或GO期，外周血细胞中是没有分裂相的I960年，Nowell和Moorhead证实，外周血中的小淋巴细胞可以在植物血凝素（phytohaemagglutinin,PHA）和其它有丝分裂刺激剂的影响下，在形态上转变为淋巴母细胞，在培养中进行有丝分裂在培养过程中加入秋水仙素可以破坏纺锤体结构，使细胞有丝分裂停止在中期，以便于染色体观察通过低渗和固定处理，就可以迅速而又简便地获得体外生长的细胞群体和有丝分裂相人体的1ml外周血中一般含有约（1〜3）X106个小淋巴细胞，足够染色体标本制备和分析之用本节介绍人外周血淋巴细胞的悬浮培养法，以及染色体标本的制备G显带是指Giemsa染液染色后，使每条染色体上显示出深浅交替横纹的技术A-T相对丰富的区域染为深带，G-C相对丰富的区域染为浅带将已经过老化的染色体制片放到37°C胰酶中进行预处理，胰酶可以从染色体上抽取特定的疏水蛋白，然后用Giemsa染色。

胰蛋白酶法制作简便，成本低廉，制作周期短，显示的带纹清晰，是研究分析染色体的主要常规方法之一三、主要仪器设备实验材料：人外周血（淋巴细胞）实验器具：离心机、恒温培养箱、恒温水浴箱、培养瓶、离心管、注射器和针头（61/2号）、吸管、量筒、火材、洒精灯、载玻片、染缸、试管架、玻璃铅笔、显微镜、擦镜纸、吸水纸等药品和试剂：肝素、秋水仙素、低渗液、固定液、磷酸缓冲液Giemsa工作液、RPMI1640培养基、小牛血清、植物血凝素（PHA）等四、操作方法与实验步骤（1）接种和培养① 在无菌条件下，用灭菌注射器吸取0.2%肝素液（生理盐水配制，灭菌）0.2ml,湿润针筒后，采静脉血2ml，转动注射器使血液与肝素充分混匀② 无菌条件下，将肝素化血液滴入至外周血培养基内，每5ml培养液内滴入血滴19滴（7号针头）轻轻混匀③ 置37°C恒温箱内，静止培养68〜72h注意第二天观察培养液有无凝血、溶血或长菌的现象，可每天将培养液摇一摇以便细胞得到充分培养④ 终止培养前2〜3h，加入浓度为10“g/ml的秋水仙素，每5ml培养基中用7号针头，加3〜4滴轻轻摇匀后，再放入恒温箱内，继续培养2〜3h，以积累较多停止在中期的分裂象。

但浓度不宜过高，时间不宜过长，以免染色体过短2）制片① 收获细胞：由恒温箱取出培养瓶，用吸管充分吹打培养瓶瓶壁，使细胞全部脱离瓶壁，然后将细胞液移至锥形离心管内，1000rpm/min，离心10min，去上清液，注意不要除去中间的白细胞层② 低渗处理：加37C预温的0.075mol/LKCl至8ml，反复吹打后，置37C水浴箱中低渗处理25min左右③ 预固定：加入新鲜制备固定液1ml（甲醇：冰醋酸=3:1），轻轻混匀④ 再离心：1000rpm/min，离心10min，吸弃上清液⑤ 固定：沿离心管壁慢慢加入现配的固定液（甲醇：冰醋酸=3:1）至5ml，轻轻混匀，固定15-25min⑥ 再离心：1000rpm/min，离心10min，吸去上清液再固定：加入现配固定液（甲醇：冰醋酸=1:3）至5ml,轻轻混匀，固定15-25min⑦ 再离心：1000rpm/min，离心lOmin,吸去上清液⑧ 再固定：加入现配的固定液（甲醇：冰醋酸=1:1）至5ml,轻轻混匀，固定15-25min⑨ 1000rpm/min，离心lOmin,留下约0.3ml的沉淀物，打匀用吸管吸取细胞悬液，从高处滴在冰水浸泡过的载玻片上，在酒精灯火焰上过几次，使细胞平铺于载玻片上。

3）酶解和染色① 取已老化的染色体制片1张置于37°C预温的pH7.0—7.2的0.125%胰蛋白酶缸中处理几秒到几十秒，最好做梯度的处理时间；取出玻片放入0.85%生理盐水中漂洗2次；将玻片在蒸馏水中漂洗两次；将标本用Giemsa染液染色8min；流水冲洗后，晾干4）镜检选择分散且显带良好的分裂相，在油镜下观察观察细胞的标准有：① 细胞完整，轮廓清晰，染色体在同一平面上均匀分布染色体形态和分散良好，没有重叠即使个别重叠，也要能明显辨别染色体② 所观察的染色体长短大致一样，处于同一有丝分裂时期在所观察的染色体周围没有多个或单个散在的染色体五、实验结果与分析图1图1中染色体均匀地分布在同一平面，形态和分散良好，没有重叠且带型清晰便于观察此细胞一共有46条染色体，在分散的染色体旁有一个处于有丝分裂间期的细胞这个视野中染色体是用胰蛋白酶处理15秒的六、讨论、心得根据观察，在胰蛋白酶处理5'时，染色体观察不到明显G带用胰蛋白酶处理10'和15'时可以找到染色良好，G带明显的染色体但用胰蛋白酶处理时间过长，染色体也不显带因此把握好胰蛋白酶处理的时间对G带的制备是很关键的因为我们需要作出不同的处理时间梯度，因此在制片时需保证载玻片上能尽量分布有细胞悬液，但是又不能大量重叠，因此滴加细胞悬液可以将其吹散，使其均匀分布。

另外，在用胰蛋白酶处理时，发现大家都是口头计数，这就会导致每个人数秒的时间不一致，因此小组之间相互参考处理时间也就不一致了建议下次可以放个秒表在一旁，便于计时显微镜下可以观察到大量的处于分裂间期的细胞处于分裂期的细胞，有的可以明显看到姐妹染色单体，有的姐妹染色单体还没有分开，这跟其所处的分裂时期有关有些染色体散在分布于视野中，可能是低渗处理过度，细胞破裂，也可能是制片时细胞摔破总之，需要仔细挑选合适的分裂相由于不同染色体经Giemsa染液染色后，显示出深浅交替横纹不一致，加上观察染色体本身的长度和结构特征，我们可以识别各个染色体通过对这些染色体计数，分类，我们可以检测此人的染色体数目上和某些结构的变异，用于细胞遗传学的分析。