基因工程2工具酶.ppt

第二章 基因工程的工具酶,第一节 限制性内切酶 第二节 DNA连接酶 第三节 DNA聚合酶 第四节 逆转录酶 第五节 DNA修饰酶,第一节 限制性内切酶,一、寄主控制的限制与修饰现象 二、II型限制性内切酶的特性 三、II型限制性内切酶切割类型 四、II型限制性内切酶重要概念 五、限制内切酶的命名,第一节 限制性内切酶 定义:能够识别和切割双链DNA(dsDNA)分子内特异核苷酸 顺序的核酸内切酶,叫做限制性核酸内切酶.,三种类型核酸内切酶特性差异,GAATTC,CTTAAG,5’ 3’,3’ 5’,限制作用,修饰作用,GAATTC,CTTAAG,5’ AATTC,CTTAA 5’,G 3 ’,3 ’ G,5’ 3’,3 ’ 5’,3 ’ 5’,5’ 3 ’,＋,EcoRI,MEcoRI,Me,Me,,,,,,,,,核酸内切限制酶EcoRI及其修饰的甲基化酶MEcoRI的限制与修饰作用 EcoRI识别序列经MEcoRI甲基化之后，就再不能被EcoRI所切割,一、寄主控制的限制与修饰现象,限制和修饰的作用,保护自身的DNA不受限制破坏外源DNA使之迅速降解,一般识别和切割4和6个核苷酸顺序,少数为5、7个核苷酸,也有识别8个核苷酸的,但无4个以下的:,Sau3A BamHⅠ 5’…… G-A-T-C-A-G-G-A-T-C-C……3’ 3’…… C-T-A-G-T-C-C-T-A-G-G……5’ 44 =256 46=4096 48 =65536,,,,,,,,,,,二、II型限制性内切酶的特性,4个,6个,λDNA 49Kb 12位点。

Bgl II 6个；BamH I 5个；Sal I 2个1、同裂酶 指来源不同但识别相同序列且切割位点相同Hind III和Hsu I,2、同位酶 识别相同的序列但切割位点不一样C-C-C-G-G-G G-G-G-C-C-C,A-A-G-C-T-T T-T-C-G-A-A,,,,C-C-C-G-G-G G-G-G-C-C-C,C-C-C-G-G-G G-G-G-C-C-C,,,,Sma I,Xma I,,,四、II型限制性内切酶重要概念,3、同尾酶这一类的限制酶来源各异，识别的靶序列也不相同，但产生相同的粘性末端G-G-A-T-C-C C-C-T-A-G-G,,,BamH I,T-G-A-T-C-A A-C-T-A-G-T,Bcl I,A-G-A-T-C-T T-C-T-A-G-A,Bgl II,G-A-T-C C-T-A-G,Sau 3A I,U-G-A-T-C-Y Y-C-T-A-G-U,Xho II,,,,,,,,,U表示嘌呤（A或G） Y表示嘧啶（T或C）,5‘-G-A-T-C 3’-,-3‘ C-T-A-G-5’,+,,,,,,,4、酶的星号活性当酶切条件改变时，酶的专一性可能会降低，以至于同一种酶可识别和切割多个的位点。

低盐（50mM）、高pH（>8）、高甘油浓度,EcoR I*,EcoR I,G-A-A-T-T-C C-T-T-A-A-G,G-A-A-T-T-A C-T-T-A-A-T,A-A-A-T-T-C T-T-T-A-A-G,G-A-G-T-T-C C-T-C-A-A-G,,,,,,,,,5、双酶切方法,同步双酶切 分步双酶切,1、命名三原则 取属名第一个大写字母,种名前两个小写字母 取变种、品系第一个字母构成限制酶的名称 在同种生物中发现几种酶,按先后顺序用罗马字母Ⅰ、Ⅱ…,,Haemophilus influenzae d III 属名 种名 株型HindⅢ,Bacillus amyloliquefaciens H 淀粉液化芽胞杆菌Escherichia coli R质粒 大肠杆菌,,,,五、限制内切酶的命名,流感嗜血菌,BamHⅠ,EcoRⅠ,DNA 1μl(1μg) buffer(10×) 2μl ddH2O 16μl 限制性内切酶 1μl(1u) 总体积 20μl,,A）确定酶切DNA的量 B）计算完全酶切所需的酶量。

C）10X反应液的体积应为终体积的1/10 D）依次加入计算好的DNA量、10X反应液、酶六、限制内切酶的反应体系,1.底物 DNA 1.1 DNA纯度: 1.1.1 RNA 与 E 结合影响有效酶浓度；1.1.2 提取时混入杂质可改变识别特异性 1.2 DNA浓度: [DNA]过大，抑制酶活，影响酶分子扩散 如：4μg DNA /1U HPaⅠ 50μl 37℃ 15h1μg DNA /1U HPaⅠ 50μl 37℃ 1h,七、影响限制性核酸内切酶反应的因素,2.识别位点及邻近位点特异性序列XmaⅢ切点（CGGCCG）在GGCGGCCGCC时不切割3.DNA二级/三级结构如：超螺旋DNA(病毒或质粒)比线状DNA需酶多,酶切1ugλDNA，需要1-2单位的酶; 酶切1ug质粒DNA，需要 3-5单位的酶4.反应系统因素 （1）缓冲液（无菌、无污染） （2）金属离子 （3）牛血清蛋白(BSA) （4) 温度与反应时间,1.DNA重组 2.构建载体 3.DNA顺序分析 4.遗传病诊断,八、限制内切酶的应用,,, DNA连接酶,定义：能够催化双链分子中相邻的3’-OH和5’-P末端之间形成磷酸二酯键,使DNA分子连接起来的酶.,一、种类,1.1 T4-DNA连接酶—从T4噬菌体感染的大肠杆菌提取1.2 大肠杆菌DNA连接酶,二、DNA连接酶的连接范围,1.粘性末端DNA连接 2.缺口的填补 3.平末端DNA连接,5’ 3’,3’ 5’,P,P,OH,OH,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,5’ 3’,3’ 5’,,,P,OH,RNA,DNA,5’ 3’,3’ 5’,OH,OH,P,P,,,,Mg2+,ATP,Mg2+,ATP,Mg2+,ATP,T4-DNA 连接酶,T4-DNA 连接酶,T4-DNA 连接酶,T4-DNA 连接酶各种催化反应活性,三、DNA连接酶的连接条件,1.双链DNA分子 2.具有3’-OH和5’-P 3.缺口处不缺核苷酸,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,缺失核苷酸的裂口,丢失磷酸二酯键的缺口,,,3’,5’,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,连接酶封闭缺口,连接酶无法封闭缺口,无活性,（a）,（b）,四、DNA连接酶的连接反应机制：,,,,3’ 5’,5’ 3’,,,,,,,,,,,3’ 5’,5’ 3’,,,,,,,,,,,3’ 5’,5’ 3’,,,,,,,,,,,,产生一个 磷酸二酯键,Amp,,酶-Amp,酶,,T4连接酶,ATP,ppi,Amp与P反应,OH,P,①T4DNA连接酶与ATP形成酶-Amp复合物,,P,P,,A,,,②酶-Amp复合物再结合到具5’-P和3’-OH切口的DNA上，使DNA腺苷化,③产生一个新的磷酸二酯键，把缺口封闭起来，完成连接作用。

P,P,P,P,P,P,P,P,P,P,P,五、T4 DNA连接酶的反应条件,10×T4 DNA Ligase Buffer 2.5 μl DNA片段* 约0.3 pmol 载体DNA** 约0.03 pmol T4 DNA Ligase 1 μl ddH2O up to 25 μl 反应温度16度，连接过夜 DNA片段的摩尔数应控制在载体DNA摩尔数的3～10倍指在DNA模板指导下，以4种脱氧核糖核苷酸（dNTP）为底物，在引物3’-OH末端聚合DNA链的一类酶一、种类 聚合酶Ⅰ（polⅠ），DNA损伤修复，在半保留复制中起辅助的作用 聚合酶Ⅱ（polⅡ），在修复损伤中有重要的作用 聚合酶Ⅲ（polⅢ），DNA复制过程中起主要作用 聚合酶Ⅰ是基因工程中的常用酶第三节 DNA聚合酶,二、DNA聚合酶的特点：1.需模板DNA； 2.需引物； 3.具有三种酶活性三、DNA聚合酶的活性,1. 5’→3’聚合酶活性,2. 5’→3’外切酶活性,3. 3’→5’外切酶活性,裂口,缺口,四、Klenow酶,1.来源：,DNA聚合酶Ⅰ,,枯草杆菌蛋白酶或胰蛋白酶,C端(76kd) + N端（36kd）,,Klenow5’→ 3’聚合 3’→ 5’外切,5’→ 3’外切,2.Klenow酶的三维结构,3.Klenow酶使用注意事项,1） 稀释时不失活，但剧烈搅拌会失活。

2） 不表现切口平移活性 3） 对模板高级结构的抵抗性能较好 4） 易发生DNA凝集作用 5） 用于3′粘性末端的修饰时有时会多加一个碱基,,,,,,,,,,,,,,,5‘ 3’,3‘ 5’,,,,,,,,,,,,,,5‘ 3’,3‘ 5’,,,,,,,*,,,*,*,*,*,*,*,*,,,,,,,(a),(b),(c),(d),(e),(a)DNaseI处理双链的DNA分子,(b)带有3’-OH末端的单链缺口,(c) polⅠ从5‘-P移去一个核 苷酸,(d) polⅠ将32P标记的核苷酸参入取代被移去的核苷酸,(e)重复(c)(d)的步骤，缺口沿5’-3‘方向移动，形成32P标记的核苷酸合成的DNA链,,五、DNA聚合酶的应用,1.制备DNA分子杂交探针(缺口平移Nick translation),,五、DNA聚合酶的应用,2.制备DNA分子杂交探针(随机引物法),五、DNA聚合酶的应用,3.cDNA第二条链的合成,五、DNA聚合酶的应用,4.测序（T7 DNA聚合酶）(Sanger双脱氧链终止法）,5‘→3’聚合，持续反应时间最长 3‘→5‘外切，是DNA 聚合酶Ⅰ的 1000倍。

2,3-双脱氧的A, C, G, T核苷三磷酸(称为ddATP, ddCTP, ddGTP, ddTTP),5.1 来源：水生栖热菌(Thermusaquaticus)yT1 5.2 活性：聚合最适温度为75-80℃，不具3’→5’外切酶活性，具5’→3’外切活性 五、DNA聚合酶的应用,5.PCR反应（Taq DNA聚合酶）,第四节 反转录酶（reverse transcriptase）,一、来源：商品反转录酶有两种来自禽类成髓细胞瘤病毒(AMV)来自Moloney鼠白血病毒(M-MLV)反转录酶,二、结构和活性：,①依赖RNA的DNA聚合酶活性,T T T T-OH,T T T TAGACAG,AAAAUCUGUC,AAAAUCUGUC,逆转录酶,Mg++ 4dNTP,,,,②依赖于DNA的DNA聚合酶活性,,,,5’,3’,,,ssDNA,,5’,3’,,逆转录酶,Mg 4dNTP,③外切RNA酶活性 (RNA酶H),,,,+寡聚RNA片段,,逆转录酶,RNA/DNA,ssDNA,,,,RNA,OH,三、用途,试剂名称 使 用 量 模板RNA 1 μg Oligo dT Primer（50 μM） 或Random Primers（50 μM） 或Specific Primer（2 μM） 1 μl dNTP Mixture (10 mM each) 1 μl RNase free dH2O up to 10 μl,65℃保温5分钟后迅速在冰上急冷2分钟以上。

四、反转录酶的反应条件：,。