糖类的分析方法.pdf

1 / 5糖分析方法（一）直接滴定法（本法是国家标准分析方法）中华人民共和国行业标准( 果汁－总糖的测定－直接滴定法) SB/T 10203-1994 Ⅰ、原理一定量的碱性酒石酸铜甲、乙液等量混合，立即生成天蓝色的氢氧化铜沉淀，这种沉淀很快与酒石酸钠反应，生成深蓝色的可溶性酒石酸钾钠铜络合物在加热条件下，以次甲基蓝作为指示剂，用标液滴定，样液中的还原糖与酒石酸钾钠铜反应，生成红色的氧化亚铜沉淀，待二价铜全部被还原后，稍过量的还原糖把次甲基蓝还原，溶液由蓝色变为无色，即为滴定终点根据样液消耗量可计算出还原糖含量样品经除去蛋白质后，在加热条件下， 以次甲基蓝做指示剂，滴定标定过的碱性酒石酸铜溶液（用还原糖标准溶液标定碱性酒石酸铜溶液），根据样品溶液消耗体积计算还原糖量Ⅱ、仪器和试剂1．仪器酸式滴定管，可调电炉（带石棉板），250ml 容量瓶2．试剂1. 盐酸2. 碱性酒石酸铜甲液：称取15g 硫酸铜（ CuSO4 · 5H2O ）及 0.05g 次甲基蓝，溶于水中并稀释至 1000mL 3. 碱性酒石酸铜乙液：称取50g 酒石酸钾钠与75g 氢氧化钠，溶于水中，再加入4g 亚铁氰化钾，完全溶解后，用水稀释至1000 ml ，贮存于橡胶塞玻璃瓶内。

4. 乙酸锌溶液：称取21.9 g 乙酸锌，加3ml 冰乙酸，加水溶解并稀释至100ml 5. 亚铁氰化钾溶液：称取10.6g 亚铁氰化钾，用水溶解并稀释至100ml 6. 葡萄糖标准溶液：准确称取1.0000g经过 96℃± 2℃干燥 2h 的纯葡萄糖， 加水溶解后加入 5ml 盐酸，并以水稀释至1000L 此溶液相当于1mg/ml葡萄糖（注：加盐酸的目的是防腐，标准溶液也可用饱和苯甲酸溶液配制）7. 果糖标准溶液：按⑹操作，配制每毫升标准溶液相当于1mg 的果糖8. 乳糖标准溶液：按⑹操作，配制每毫升标准溶液相当于1mg 的乳糖9. 转化糖标准溶液：准确称取1.0526g纯蔗糖，用100ml 水溶解，置于具塞三角瓶中加5ml 盐酸（ 1+1 ） ，在 68 ℃~70 ℃水浴中加热15min ，放置至室温定容至1000ml ，每 ml标准溶液相当于1.0mg 转化糖Ⅲ、实验步骤1．样品处理⑴乳类、 乳制品及含蛋白质的食品：称取约 2.50 ～5.00g 固体样品 （吸取 25 ～50ml 液体样品） ，2 / 5置于 250 ml 容量瓶中，加50 ml 水，摇匀边摇边慢慢加入5ml 乙酸锌溶液及5ml 亚铁氢化钾溶液，加水至刻度，混匀。

静置30 min ，用干燥滤纸过滤，弃去初滤液，滤液备用注意：乙酸锌可去除蛋白质、鞣质、树脂等，使它们形成沉淀，经过滤除去如果钙离子过多时，易与葡萄糖、 果糖生成络合物，使滴定速度缓慢； 从而结果偏低， 可向样品中加入草酸粉，与钙结合，形成沉淀并过滤⑵酒精性饮料：吸取100ml 样品，置于蒸发皿中，用1 mol/L 氢氧化钠溶液中和至中性，在水浴上蒸发至原体积1/4 后，移入250ml 容量瓶中，加水至刻度⑶含多量淀粉的食品：称取10.00 ～20.00g 样品，置于250ml 容量瓶中，加200ml 水，在 45 ℃水浴中加热1h，并时时振摇（注意：此步骤是使还原糖溶于水中，切忌温度过高，因为淀粉在高温条件下可糊化、水解， 影响检测结果冷后加水至刻度，混匀， 静置， 沉淀 吸取 200ml上清液于另一250ml 容量瓶中， 慢慢加入5ml 乙酸锌溶液及5ml 亚铁氢化钾溶液， 加水至刻度，混匀，沉淀，静置30 min ，用干燥滤纸过滤，弃去初滤液，滤液备用⑷汽水等含有二氧化碳的饮料：吸取100ml 样品置于蒸发皿中，在水浴上除去二氧化碳后，移入 250ml 容量瓶中，并用水洗涤蒸发皿，洗液并入容量瓶中，再加水至刻度，混匀后备用。

（注意：样品中稀释的还原糖最终浓度应接近于葡萄糖标准液的浓度2. 标定碱性酒石酸铜溶液：吸取5.0ml 碱性酒石酸铜甲液及5.0ml 乙液，置于150ml 锥形瓶中（注意： 甲液与乙液混合可生成氧化亚铜沉淀，应将甲液加入乙液，使开始生成的氧化亚铜沉淀重溶），加水10 ml ，加入玻璃珠2 粒，从滴定管滴加约9 ml 葡萄糖标准溶液或其他还原糖标准溶液， 直至溶液兰色刚好褪去为终点，记录消耗的葡萄糖标准溶液或其他还原糖标准溶液总体积，平行操作三份，取其平均值，计算每10 ml （甲、乙液各5 ml ）碱性酒石酸铜溶液相当于葡萄糖的质量或其他还原糖的质量（mg）注意：还原的次甲基蓝易被空气中的氧氧化，恢复成原来的蓝色，所以滴定过程中必须保持溶液成沸腾状态，并且避免滴定时间过长3. 样品溶液预测：吸取5.0 ml 碱性酒石酸铜甲液及5.0 ml 乙液，置于150 ml 锥形瓶中，加水10 ml ，加入玻璃珠2 粒，控制在2 min 内加热至沸，趁沸以先快后慢的速度，从滴定管中滴加样品溶液，并保持溶液沸腾状态，待溶液颜色变浅时，以每两秒1 滴的速度滴定，直至溶液蓝色褪去，出现亮黄色为终点如果样品液颜色较深，滴定终点则为兰色褪去出现明亮颜色（如亮红），记录消耗样液的总体积。

注意：如果滴定液的颜色变浅后复又变深，说明滴定过量，需重新滴定当试样溶液中还原糖浓度过高时应适当稀释，再进行正式测定，使每次滴定消耗试样溶液的体积控制在与标定碱性酒石酸酮溶液时所消耗的还原糖标准溶液的体积相近，约在10ml 左右当浓度过低时则采取直接加入10ml 样品溶液，免去加水10ml ，再用还原糖标准溶液滴定至终点，记录消耗的体积与标定时消耗的还原糖标准溶液体积之差相当于10ml 试样溶液中所含还原糖的量4. 样品溶液测定：吸取5.0 ml 碱性酒石酸铜甲液及5.0 ml 乙液，置于150 ml 锥形瓶中，加水10 ml ，加入玻璃珠2 粒，在 2 min 内加热至沸，快速从滴定管中滴加比预测体积少1 ml 的样品溶液，然后趁沸继续以每两秒1 滴的速度滴定直至终点记录消耗样液的总体积，同法平行操3 / 5作两至三份，得出平均消耗体积5. 计算样品中还原糖的含量（以某种还原糖计）按下式计算X=〔A/(m×V/250 × 1000) 〕× 100 式中： X-- 样品中还原糖的含量(以某种还原糖计)，单位g/100g ；A—碱性酒石酸铜溶液（甲、乙液各半）相当于某种还原糖的质量，单位mg ；m-- 样品质量，单位g；V-- 测定时平均消耗样品溶液的体积，单位ml；计算结果保留小数点后一位。

注意：滴定结束，锥形瓶离开热源后，由于空气中氧的氧化，使溶液又重新变蓝，此时不应再滴定二）高锰酸钾滴定法原理将样液与一定量过量的碱性酒石酸铜溶液反应，还原糖将二价铜还原为氧化亚铜，经过滤，得到氧化亚铜沉淀，加入过量的酸性硫酸铁溶液将其氧化溶解，而三价铁盐被定量地还原为亚铁盐，用高锰酸钾标准溶液滴定所生成的亚铁盐，根据高锰酸钾溶液消耗量可计算出氧化亚铜的量，再从检索表中查出氧化亚铜量相当的还原糖量，即可计算出样品中还原糖含量三）硫酸苯酚法Ⅰ、原理糖在浓硫酸作用下，脱水形成的糠醛和羟甲基糠醛能与苯酚缩合成一种橙红色化合物，在 10-100mg 范围内其颜色深浅与糖的含量成正比，且在485nm波长下有最大吸收峰，故可用比色法在此波长下测定苯酚法可用于甲基化的糖、戊糖和多聚糖的测定，方法简单，灵敏度高，实验时基本不受蛋白质存在的影响，并且产生的颜色稳定160min 以上多糖在硫酸的作用下先水解成单糖，并迅速脱水生成糖醛衍生物，然后与苯酚生成橙黄色化合物再以比色法测定Ⅱ、试剂1． 浓硫酸：分析纯，95.5% 2． 80%苯酚： 80 克苯酚（分析纯重蒸馏试剂）加20 克水使之溶解，可置冰箱中避光长期储存。

3． 6%苯酚：临用前以80% 苯酚配制每次测定均需现配）4． 标准葡聚糖（Dextran,瑞典 Pharmacia ） , 或分析纯葡萄糖5． 15%三氯乙酸（ 15%TCA ）： 15 克 TCA加 85 克水使之溶解，可置冰箱中长期储存4 / 56． 5%三氯乙酸（ 5%TCA ）：25 克 TCA加 475 克水使之溶解，可置冰箱中长期储存7． 6mol/L 氢氧化钠： 120 克分析纯氢氧化钠溶于500ml 水 8． 6mol/L 盐酸Ⅲ、操作1．制作标准曲线：准确称取标准葡聚糖（或葡萄糖）20mg于 500ml 容量瓶中，加水至刻度，分别吸取0.4 、0.6 、0.8 、1.0 、1.2 、1.4 、1.6 及 1.8ml,各以蒸馏水补至2.0ml ， 然后加入 6% 苯酚 1.0ml 及浓硫酸 5.0ml, 摇匀冷却，室温放置20 分钟以后于490nm测光密度，以2.0ml 水按同样显色操作为空白，横坐标为多糖微克数，纵坐标为光密度值，得标准曲线2．样品含量测定：①取样品1 克（湿样）加1ml 15%TCA溶液研磨，再加少许5％TCA溶液研磨，倒上清液于10 毫升离心管中，再加少许5％TCA溶液研磨，倒上清液，重复3 次。

最后一次将残渣一起到入离心管注意：总的溶液不要超出 10 毫升 （既不要超出离心管的容量）②离心，转速3000 转/ 分钟，共三次第一次15 分钟，取上清液后两次各 5 分钟取上清液到25 毫升锥形比色管中最后滤液保持18 毫升左右 测肝胰腺样品时，每次取上清液时应过滤因为其脂肪含量大容易夹带残渣 ）③水浴，在向比色管中加入2 毫升 6mol/L 盐酸之后摇匀，在96℃水浴锅中水浴2 小时 ④定容取样 水浴后，用流水冷却后加入2毫升 6mol/L 氢氧化钠摇匀 定容至 25 毫升的容量瓶中吸取0.2 ml 的样品液，以蒸馏补至2.0ml ，然 后加入6% 苯酚 1.0ml及浓硫酸5.0ml, 摇匀冷却室温放置20 分钟以后于 490nm测光密度每次测定取双样对照以标准曲线计算多糖含量 Ⅳ、注意（1）此法简单、快速、灵敏、重复性好，对每种糖仅制作一条标准曲线，颜色持久2）制作标准线宜用相应的标准多糖，如用葡萄糖， 应以校正系数0.9校正 μg 数3）对杂多糖，分析结果可根据各单糖的组成比及主要组分单糖的标准曲线的校正系数加以校正计算 （4）测定时根据光密度值确定取样的量光密度值最好在0.1 —— 0.3 之间。

比如：小于 0.1 之下可以考虑取样品时取2 克，仍取 0.2ml 样品液， 如大于 0.3 可以减半取0.1ml 的样品液测定5 / 5（四）蒽酮法Ⅰ、实验原理糖在浓硫酸作用下，可经脱水反应生成糠醛和羟甲基糠醛，生成的糠醛或羟甲基糠醛可与蒽酮反应生成蓝绿色糠醛衍生物，在一定范围内， 颜色的深浅与糖的含量成正比，故可用于糖的测定该法的特点是几乎可以测定所有的碳水化合物，不但可以测定戊糖和己糖，而且可以测所有的寡糖类和多糖类，其中包括淀粉、 纤维素等 （因反应液中的浓硫酸可以把多糖水解成单糖而发生反应所以， 用蒽酮法测出的碳水化合物含量，实际上是溶液中全部可溶性碳水化合物总量在没有必要细致划分各种碳水化合物的情况下，用蒽酮法可以一次测出总量此外，不同的糖类与蒽酮试剂的显色深度不同，果糖显色最深，葡萄糖次之，半乳糖、甘露糖较浅，五碳糖显色更浅故测定糖的混合物时，常因不同糖类的比例不同造成误差，但测定单一糖类时，则可避免此种误差Ⅱ、试剂：蒽酮试剂， 0.20 g蒽酮溶入 100 mL 95% 浓硫酸中，冰箱保存；Ⅲ、方法：样品 2.0 mL加 5.0 mL蒽酮试剂，混匀，然后水浴煮沸 10 min， 取出冷却至室温，在 620 nm 处测定其吸光度， 根据标准曲线计算水样中糖的浓度。

（标线以葡萄糖为标样）。