蛋白质与酶工程知识点---仅供参考.docx

学习必备 欢迎下载1、易错 PCR :通过调整反应条件来使 PCR 扩增过程中复制 错配率 增加，在目的基因中随机引入突变，继而获得蛋白质分子的随机突变体* 提高镁离子浓度或加入锰离子* 降低体系中一种的 dNTP 浓度（至少 5-10% ）* 运用低保真度 DNA 聚合酶* 增加 DNA 聚合酶的浓度属于无性进化：单一基因内进行遗传突变，费劲、耗时，多用于小片段（ 800bp 以下）2、酶的概念： 酶是一类由活细胞产生的，对其特异底物（ substrate）具有高效催化作用的 生大分子，包括蛋白质和核酸学习必备 欢迎下载+3、辅酶 : 与酶蛋白结合疏松，可用透析或超滤的方法除去 〔NAD〕 ；辅基 : 与酶蛋白结合紧密，不能用透析或超滤的方法除去 〔FAD、FMN〕酶的活性中心 ：或称活性部位，指必需基团在空间结构上彼此靠近，组成具有特定空间结构的区域，能与底物特异结合并将底物转化为产物；学习必备 欢迎下载4、抗体酶或催化抗体 ：是具有催化功能的抗体；本质：免疫球蛋白，即具有催化作用的免疫球蛋白5、酶促反应特点 ：① 酶促反应具有极高的效率② 酶促反应具有高度的特异性： 肯定特异性、 相对特异性、 立体结构特异性③ 酶促反应的可调剂性：对酶量的调剂，对酶活性的调剂6、诱导契合假说： 酶与底物相互接近时，其结构相互诱导、相互变形和相互适应，进而相互结合；这一过程称为酶 -底物结合的诱导契合假说 ；7、底物浓度对反应速度的影响 ：① 当底物浓度较低时：反应速度与底物浓度成正比；反应为一级反应；② 随着底物浓度的增加： 反应速度不再成正比例加速； 反应为混合级反应；③ 当底物浓度高达肯定程度： 反应速度不再增加， 达最大速度； 反应为零级反应 ‹ 〔są- Km i›t ‹ :‹” ‹*ź - › v =, [S] = Km ‹I8. Km —*Vmax gt6 X Kmń źi ›1f• ”„ -.<— *‹\.- *› -F1ź ›•-›t. . ›,Ńł*ł— ć/ć›- g-ź Ci 1. —ńr“ al..z* al ‹r›“›.•"›/..r›j - -”_ >*I-r ź — 11-T-›:/‹t ›"›-.I--›ć-. + S—i- .ż*1*ń.fi —ńłuń-tKm 6=K, / K, Km = k,1/Ksf:x›S6&1@-1&tat1f•›t1•J•.a ..w +x, . K, x,t, K,x•- a‹c, - n , ./*.5+›Q›tt@Kg / K . lt › : Km@.k@@@@7@—/Km{@@ .学习必备 欢迎下载9、不行逆性抑制作用 ：抑制剂通常以共价键与酶活性中心或活性中心以外的必需基团相结合，使酶失活；可逆性抑制作用 ：抑制剂通常以非共价键与酶或酶 - 底物复合物可逆性结合，使酶的活性降低或丢失；抑制剂可用透析、超滤等方法除去； 类型：竞争性抑制、非竞争性抑制、反竞争性抑制；三种抑制剂的特点学习必备 欢迎下载学习必备 欢迎下载学习必备 欢迎下载10、酶的调剂：酶活性的调剂（快速调剂）① 酶原与酶原的激活② 变构（別构）酶③ 酶的共价修饰调剂 酶含量的调剂（缓慢调剂）① 酶蛋白合成的诱导和阻遏② 酶降解的调控11、酶原激活的意义防止细胞产生的酶对细胞进行自身消化， 并使酶在特定的部位和环境中发挥作用，保证体内代谢正常进行； （消化管内的蛋白酶）有的酶原可以视为酶的储存形式； 在需要时， 酶原适时地转变成有活性的酶， 发挥其催化作用；（凝血酶与纤溶酶类）12、变构调剂一些代谢物可与某些酶分子活性中心外的某部分可逆地结合，使酶构象转变，从而转变酶的催化活性，此种调剂方式称变构调剂13、两种操纵子：乳糖操纵子、色氨酸操纵子14：细胞破裂法： 试验室小规模① 旋刀匀浆法② 研磨法③ 高速珠磨法④ 反复冻融学习必备 欢迎下载⑤ 渗透压破裂法⑥ 超声匀浆法大规模提取：高压匀浆法15、 解吸方法 --洗脱原理①加大反离子的浓度，常用的反离子 是NaCl②转变溶液的 pH（转变结合基团的电荷）③同时转变 pH 与离子强度交换剂挑选的一般原就：*酶蛋白稳固存在的 pHpI ，用阴离子交换剂*两种 pH条件下均能稳固存在，二种交换剂均可4、蛋白质与酶的结构和功能16、 氨基酸的分类：学习必备 欢迎下载17、 拉氏构象图 ：两相邻肽键平面可相对旋转（构象角 φ ,ψ ）：环绕 Cα 旋转的构象与角度学习必备 欢迎下载18、 蛋白质一级结构 ：多肽链中氨基酸的排列次序；主要化学键：肽键（ +二硫键）学习必备 欢迎下载19、 α 螺旋 〔α -helix〕： 多肽链的主链原子沿一中心轴盘绕所形成的有规律的右手螺旋构象；简言之，各个肽平面环绕同一轴旋转形成的右手螺旋构象；学习必备 欢迎下载两亲性螺旋 ：（重要） 氨基酸侧链从螺旋骨架伸出，形成螺旋表面一侧亲水（带电、极性） ，一侧疏水（易形成疏水内核或疏水表面聚合）的特性；螺旋转轮 ：螺旋沿着螺旋轴的二维投射图，可以判定 alpa螺旋是否具有两亲性； 影响 α -螺旋稳固因素：⑴侧链基团空间位阻：如 Ile 、Trp 、Phe侧链基团；⑵连续氨基酸侧链基团带有相同电荷（同种电荷互斥）⑶ Pro等亚氨基酸存在（不能形成氢键 ,且Cα 参加吡咯环形成，环内 Cα -N 和C-N 键不能旋转）；B.Д@&/@〔Дsheet/strand〕Trp, Ile, Val, Thr, Щs 〕 ›•кс.ааа,<. atж+sasa ‹s0R]ф$$$ЇЙЇ1@I&іЇіГј&@ЈІЇЇ$ЄЅ$, $ЄЙaнaя2ox› . aauaвoz.C. @@〔Дturn〕•eкn+ssвesяa 〔sя . siy. а › ‹ языsмв.ае “е’ОО: Asp, Asn, Ser, Cys ОбФ • tЭ42 : Pro3 : GIy1яAsn〔II〕4 : GlyD.@〔loop〕 : @@@@@2Ğ“@@@@@ı •aı•m•‹snessx‹sv. •.g&Axaegoso—@RI@&O4Łass学习必备 欢迎下载20、 motif 的层次、线性 motif 的概念（重要）Linear Motif3tf.Short Lineor Notifs〔SLiHs〕. &6B @.@ 6 B2Lf.% fT.t 2 BBiJ/t.ft. 〔fs6aOaaskza....pzJ›s.ea49LxCxE MotifE2FN-aacsc1〕3.3 - Jtf\.f@‹ I/I@@〔Structure Domain〕—ai0ASi&—9ta6Ji&aJ5&i3i4ESt4ila&& t $taISY8i1, &xi&1 &W i2leRJn t$S&.r I Yt$l9&&Jil\› . iili e iti50—z00k$i4i$$Jii4i&&• tit@IB‹+ & Q @ 〔2096〕 . 60-B06aIpha@@〔g@gQggJg@g@@g.@$j@@jgQ@g 〕学习必备 欢迎下载21、四级结构： 两条和两条以上多肽寡聚蛋白或多聚蛋白质形成的高级结构；亚基种类、 数目、空间排布以及亚基互作是四级结构稳固因素；学习必备 欢迎下载5、 蛋白质与酶的修饰技术1、酶分子修饰的概念和意义：概念 ：通过各种方法转变蛋白 /酶的分子结构，从而转变其某些特性和功能；主要途径有化学途径和分子生物学途径；意义：① 提高蛋白 / 酶的活力 ,满意 /适应生产工艺的要求② 增强蛋白 / 酶的稳固性③ 提高、降低或排除蛋白 /酶的抗原性④ 讨论和明白蛋白 /酶的结构：⑤ 补偿自然蛋白的不足，给予优良性状2、化学修饰的手段与方法：学习必备 欢迎下载常常被修饰的残基：亲核：丝、半胱、甲硫、苏、赖、组亲点：酪、色3、侧链基团的修饰（ 1）羧基 修饰反应 ---------- 水溶性碳二亚胺类（最标准） 、硼氟化三甲烊盐（ 2）氨基 修饰：采纳某些化合物使酶分子。