荧光定量PCR检测结直肠癌腹腔CEA水平及其临床意义的研究【临床医学论文】.doc

临床医学论文-荧光定量 PCR 检测结直肠癌腹腔 CEA 水平及其临床意义的研究【摘要】 目的：应用实时荧光定量 PCR 技术检测结直肠癌腹腔内 CEA 水平并探讨其临床意义方法：2003 年 5 月至 2004 年 3 月，收集在日本爱知癌症中心手术 107 例结直肠癌病例的腹腔冲洗液，每个样本的 cDNA 应用随机引物合成，并在罗氏的实时荧光定量 PCR（LightCycler）上进行定量分析每个样本同时进行常规细胞学检查所有病例术后经过平均为 1 年的随访结果：CEA mRNA的阳性率和水平均与肿瘤的侵润度（T），分期以及淋巴结转移相关在一个合理界定值上，CEA 和 CK20 检测的敏感度与特异度均为 100%和 100%,而常规的细胞学检查则为 33%和 100%结论：CEA 定量分析是检测结直肠癌腹腔微转移的敏感和特异的方法，CEA mRNA 水平的异常与术后的无瘤生存率显着相关其临床意义有待于更长期的随访结果 【关键词】 结直肠癌 CEA 实时荧光定量 RTPCRAbstract Objective:The purpose of this study is to detect CEA level in peritoneal cavity of colorectal cancer patients by quantitative Realtime RT PCR method and investigate its clinical significance. Methods: From May 2003 to Mar. 2004, peritoneal wash was obtained from 107 patients with colorectal cancer in Aichi cancer center. cDNA was synthesized from mRNA extracted from peritoneal washes by Random primers. Quantification of CEA mRNA was performed on a LightCycler instrument (Roche) with hybridization probe. A part of each peritoneal wash was also examined by conventional cytology. All patients were followed up for a median period of at least 12 months. Results: Both CEA mRNA positive rates and values were significantly correlated with depth of tumor invasion, tumor stage, lymph node status. Sensitivity and specificity of CEA and CK20 realtime RTPCR with an appropriate cutoff value were 100%, 100%, and 100%, 100%, respectively, whereas those of conventional cytology were 33%, and 100%, respectively. Conclusion: CEA mRNA quantifications is sensitive and specific method for detection of micrometastases in the peritoneal washes of colorectal cancer patients. Abnormality of CEA mRNA level in peritoneal washes is correlated with disease free survival for colorectal cancer patients. Further followup study is needed to demonstrate the clinical significance of CEA mRNA in peritoneal washes.Key words Colorectal carcinoma;CEA; Realtime RTPCR结直肠癌为常见多发的消化道恶性肿瘤，随着生活水平的提高和饮食习惯的改变，结直肠癌的人群患病率有所上升，并有年轻化趋向。

全国每年约有新发结直肠癌病例 13 万已经跃居我国恶性肿瘤死亡率的第四位长江下游与东南沿海的江苏、浙江、上海、福建、台湾和香港地区是结直肠癌高发区浙江省肿瘤医院资料显示，近 9 年来收治率增加 98%，平均每年增加 10.9%与 90年代初相比，收治率则增加 515%目前，结直肠癌患者尽管接受了以手术为主的根治术，但临床上仍有 50％的结直肠癌患者死于术后的肿瘤局部复发和转移, 成为手术治疗失败的主要原因[1,2]因此应用先进的分子生物学技术、建立定量荧光 RTPCR 方法检测结直肠癌肿瘤标志物、术后转移的早期诊断受到高度重视癌胚抗原（Carcinoembryonic Antigen,CEA）是分子量为 180000 的细胞表面糖蛋白，是结直肠癌细胞去分化过程中表达的一个重要标志，是最有价值的肿瘤标志物之一90％的结直肠癌、胃癌、胰腺癌有 CEA 的高表达自 1965 年应用于临床以来已作为胃肠道肿瘤的诊断和判断预后的监测指标CEAmRNA 指标可确定结肠癌及直肠癌是否发生肝转移本研究应用实时荧光定量反转录聚合酶链式反应（RTPCR ）技术，检测结直肠癌患者手术腹腔冲洗液中游离细胞的癌胚抗原(CEA)mRNA 特异性标志物，并检测 3 磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)mRNA 为内参因子[3]。

结合术后对患者随访，研究结果将正确诊断肿瘤侵润程度和复发可能性，对结直肠癌术后转移的早期诊断有重要意义同时为肿瘤患者术后放疗、化疗方案确定提供参考依据，以提高患者生活质量和患者生存率1 病例和方法1.1 细胞株:人结肠癌肝转移表达 CEA 中分化腺癌细胞株，由日本爱知癌症中心癌症研究所肿瘤病理实验室建立，并培养于加入 10%小牛血清（GIBCO BRL,Gaithersburg）,100 unit/mL 青霉素和 100 ug/mL 链霉素的 DMEM 培养基（Nissui Pharmaceutical, Tokyo, Japan）中1.2 病例收集:收集从 2003 年 5 月至 2004 年 4 月在爱知癌症中心手术的107 例结直肠癌病例，其中包括 60 例结肠癌，45 例直肠癌，以及 2 例结直肠双发癌病例分期根据 2001 版 UICC 分期：10 例 0 期，21 例 I 期，34 例Ⅱ期，31 例Ⅲ期，11 例Ⅳ期病理类型为：高分化腺癌 4 例，中分化腺癌 89 例，低分化腺癌 8 例，黏液腺癌 4 例，未分化癌 1 例1.3 腹腔冲洗液的收集和保存:手术开始进腹后，立刻分别用 100 mL 生理盐水冲洗盆底，和膈下，轻微搅拌后回收冲洗液。

离心（1800 r/min，5 min），PBS 重新冲洗游离细胞沉淀，溶解于 Isogen 溶液中(Nippon Gene, Tokyo, Japan)，-80 度保存至使用其中一部分冲洗液同时常规 Papnicolaou 染色，以进行细胞学检查1.4 实时 RTPCR 检测：应用随机引物和寡核苷酸引物检测腹腔冲洗液游离细胞 CEA mRNA,CK20 mRNA 和 GAPDH mRNA，经细胞总 RNA 提取——cDNA 合成——实时荧光定量 RTPCR 步骤寡核苷酸引物为：CEA 引物： 5’AACTTCTCCTGGTCTCTCAGCT,5 ’GCAAATGCTTTAAGGAAGAAG;荧光探针：5’TGAAATGAAGAAACTACACCAGG,5 ’CTGCTATATCAGAGCAACCCCAAGAPDH 引物：5’TGAACGGGAAGCTCACTGG,5 ’TCCACCACCCTGTTGCTGTA荧光探针： 5’TCAACAGCGACACCCACTCCT,5 ’CACCTTTGACGCTGGGGCTPCR 的扩增使用 Roche 的 LightCycler 扩增仪，总反应体积为 10 ul 包括：Taq DNA 聚合酶，dNTP 混合物和缓冲，(LightCycler DNA Master hybridization probes, Roche), 4.0 mM MgCl2, 0.25 uM 引物 D 和 E, 0.4 uM的探针，1 ul 的模板 cDNA,于 Roche 的毛细管中。

95℃(10 秒)变性，50℃ -55℃ (10 s)淬火，72℃ (10 s)延伸，共 50 次循环，每次试验包括 6 个外对照管，1 个阴性对照管，和未知浓度患者样品管mRNA 的定量可在 LightCycler上与标准曲线对照后由软件自动计算得出1.5 统计分析:根据肿瘤浸润深度 T，肿瘤分期，淋巴结转移，应用卡方检验进行组间 CEA mRNA 值显着性的差异无瘤生存率用 KaplanMeier 方法计算1.6 术后随访：所有病例均入全日本结直肠癌病例库并按照爱知癌症中心术后随访程序随访，无失访随访截至日期到 2005 年 12 月 31 日2 结 果2.1 常规细胞学检查:所有 107 例病例均做常规术中脱落学检查，只有 2例（1.9%）诊断为阳性2.2 结直肠癌腹腔冲洗液中 CEA 水平:利用引物合成 CEA mRNA 在 10 个黏膜层和黏膜下层的早期癌中均未能检出 根据以往在爱知癌症研究所的研究中，将界定值定在 1.0 大于 1.0 定为阳性，小于 1.0 定为阴性从盆底和膈下收集的标本只要有一处 CEA mRNA 值为阳性，该病例定为阳性应用实时荧光定量 PCR, 共检测了 107 例腹腔冲洗液标本，RTPCR 阳性率为 22.4%（24/107）。

在 pTis1, pT2, pT3 和 pT4 各组病例中，阳性率分别为 0%, 0%, 26.8%（11/41），76.5%（13/17），(P<0.05)，各组病例的平均值分别为：0，0，700.2, 1125.8CEA mRNA 平均值与淋巴结转移关系：CEA mRNA 平均值在淋巴结转移阴性，淋巴结转移阳性病例中阳性率分别为7.7%（5/65），45.2%（19/42）(P<0.05),平均值为 65.03，1687.05(P<0.01)CEA mRNA 与肿瘤分期关系：在 1，2，3，4 期各组病例中，阳性率分别为 0%, 14.7%(5/34),32.2%(10/31)，81.8%(9/11)，(P<0.05)，各组病例的平均值分别为：0，124.32，776.36,1119.74(P<0.01)腹腔转移阳性病例的 CEA mRNA 平均值（1196.90）显着高于腹腔转移阴性病例（36.32）(P<0.01)5 例有腹膜转移阳性的病例在镜下均诊断为 pT3pT4 ，其中只有一例常规细胞学检查结果为阳性（敏感度为 20%）而实时荧光定量 PCR 结果为阳性（敏感度为 100%）。

各种病理学因素，与 CEA 的关系见表 1表 1 CEA 和各种病理学因素关系2.4 初步随访结果：随访时间平均为 12 个月（范围为 6～20 个月），共有 6 例患者出现复发和转移，其中包括腹腔内转移 2 例，肝转移 3 例，肺转移1 例。