细胞cck8检测实验资料.pdf

细胞增殖细胞增殖- -毒性实验步骤毒性实验步骤 1 1、、细胞复苏、细胞传代、细胞计数、细胞增殖细胞复苏、细胞传代、细胞计数、细胞增殖- -毒性实验步骤：毒性实验步骤： 实验准备：用 75%酒精擦生物安全柜台面 2 遍，紫外线消毒 30 分钟（枪、枪头、 15ml 及 50ml 离心管、剪刀、封口膜、记号笔、打火机、酒精灯、培养瓶） ，复 温实验所需试剂[细胞培养液 （DMEM、 1640） 、 磷酸缓冲盐溶液 （PBS） 、 胰酶 （0.25% Trypsin-EDTA） 、胎牛血清（FBS） 、双抗]，所有的试剂、仪器放入生物安全柜前 要用酒精喷洒消毒显微镜下看细胞生长状态，有无污染 1）从液氮中取出细胞株,37-40℃温水迅速复苏，常规培养于含 10%FBS、80U/ml 青霉素及 0.08mg/ml 链霉素的培养基中，放入 ３７ ℃、５％ＣＯ２、饱和湿度 的培养箱中培养，每 ２ 天换液 １ 次 2）倒去培养瓶内的培养液； 3）加入 PBS 2ml 洗涤培养瓶内细胞 2 次； 4）加入胰酶 500ul/0.5ml 2～10min（具体时间因细胞而异，可在显微镜下看是 否贴壁，必要时轻拍培养瓶促使细胞脱落） ； 5）加入含 10%FBS 的培养液 1～1.5ml[培养液：胰酶=（2～3）:1]中和胰酶； 6）轻轻吹打成单细胞悬液，吹打力度以不起气泡为宜； 7）将单细胞悬液吸入 10～15ml 离心管中，低速离心 800rpm 3 分钟，倒去上清 液； 8）加入含 10%FBS 细胞培养液 1～2ml 吹打悬浮细胞至单细胞悬液； 9）吸取 20ul 细胞悬液（10ul 细胞悬液+10ul 台盼兰液：给坏死细胞染色，判断 细胞活力）至细胞计数板，进行细胞计数； CCK-8CCK-8 实验：实验： 10）在 96 孔板中，给每孔加 100μL（约 10000 个细胞）的细胞悬液，每组设 ５ 个复孔，将培养板放在培养箱预培养 24-72 小时（37℃，5%CO2） ，使细胞贴壁； 11）向培养板中加入 100ul 含药物培养基 12）将培养板在培养箱干预 24、48、72ｈ后，每孔加入 20ulCCK-8 液，在培养 箱继续培养 0.5-２ｈ，酶标仪检测 450nm 处吸光值（A） ，计算抑制率 抑制率＝（阴性对照 A 值－ 二甲双胍各浓度 A 值）／阴性对照 A 值×100% 注意： 如果待测物质有氧化性或还原性的话， 可在加 CCK 之前更换新鲜培养基 （除 去培养基，并用培养基洗涤细胞两次，然后加入新的培养基） ，去掉药物影响。

当然药物影响比较小的情况下，可以不更换培养基，直接扣除培养基中加入药物 后的空白吸收即可 13）若暂时不测定 OD 值，可以向每孔中加入 10μL 0.1M 的 HCL 溶液或者 1% w/v SDS 溶液，并遮盖培养板避光保存在室温条件下 24 小时内测定，吸光度不会发 生变化 CCK8 对照组的设置及测定的注意事项对照组的设置及测定的注意事项 设定参比波长：设定参比波长： CCK8 试剂在参比波长处没有吸光度，设定参比波长为了去除由于样品浑浊所带来的吸 光度 设定空白对照：设定空白对照： 1.在不含细胞的培养基中加 CCK8，测定 450nm 的吸光度作为空白对照 2.在做加药实验（细胞毒性实验）时，还应考虑药物的吸收，可在不含细胞、加入药 物的培养基中测定 450nm 的吸光度作为空白对照 合适的合适的 OD 值范围：值范围： 一般 OD 值在 0.1-2.0 范围内，在 1.0 左右较好 吸光值太高：吸光值太高： 1.细胞数量过多，应适当减少细胞量 2.CCK8 试剂孵育时间过长，应缩短孵育时间（1-2 小时） CCK8 标准曲线、检测时间、终止反应以及减少加样误差的方法标准曲线、检测时间、终止反应以及减少加样误差的方法 培养板的选择培养板的选择 除 96 孔板外，24 孔板、12 孔板均可用于 CCK8 检测，只是采用 24 孔板、12 孔板 CCK8 的用量较多，使用量仍为培养基体积的 1/10。

减少减少 CCK8 加样的误差：加样的误差： 1.避免 CCK8 在枪头和孔壁上的残留 2.可在加样前用培养基稀释 CCK8 试剂并混匀后加样 制作标准曲线的方法：制作标准曲线的方法： 1.取已知细胞数量的细胞悬液加入到培养板中 2.用培养基依次等比例稀释成一个系列浓度的细胞悬液 3.细胞培养一段时间后加入 CCK8 试剂孵育 1-4 小时 4.酶标仪进行测定，以细胞数量为 X 轴，OD 值为 Y 轴，就可以制作标准曲线 CCK8 加入后最佳的检测时间：加入后最佳的检测时间： 1.CCK8 试剂和细胞内的脱氢酶反应是一个循环反应，随着时间的增加，颜色 不断加深，OD 值也会不断增加，但细胞数量却没有变化 2.一般情况下，建议在确定最佳的实验条件（合适的时间、合适的 OD 值）后， 把加入 CCK8 试剂后的培养时间固定下来，以后在同样的培养时间点进行检 测 终止终止 CCK8 显色的几种方法（显色的几种方法（96 孔板）：孔板）： 1.每孔加入 10ul 0.1M HCl 溶液 2.在显色反应后，将培养板放入 4 度冰箱内 3.每孔加 10ul 1%（W/V）的 SDS 溶液。