动态接触条件下固定抗菌剂抗菌活性测定的标准试验方法.doc

动态接触条件下固定抗菌剂抗菌活性测定的标准试验方法本标准按 E 2149 确定的标准颁布; 紧随名称的数字表示最初采用的年份，在修订的情况下，则表示最终修订版本的年份括号内的数字表示最后一次重新核定的年份上标 ε表示自上次修订或重新核定的编辑修改1.范围这种测试方法的目的是评估动态接触条件下，非溶出抗菌处理的试样微生物的生长的抵抗能力这种动态摇瓶试验的开发是为了在常规质量控制和筛选试验中，克服采用传统测试方法来评估基质限制抗菌能力过程中的困难这些困难包括保证接触培养液的处理面（如在 AATCC 100），在不同接触时间下检索的灵活性，使用不适当应用静态条件（如在 AATCC 147），灵敏度，和可重复性该测试还允许测试由以下因素如硬水、蛋白质、血液、血清、各种化学品、以及其他污物或物理/化学应力或样本操作等引起的污染1.2 表面的抗菌活性是由样品同时运行控制测试的结果进行比较后决定的1.3 浸出抗菌剂的存在是由测定前后抑制区的存在共同决定的1.4 本测试方法应该只有通过微生物技术培训才能完成1.5 本标准可能涉及危险性物质，操作和设备本标准不旨在解决所有的安全问题，如果有的话，与其使用有关。

在使用之前建立适当的安全和健康措施，并确定规章限制的适用性，是本标准使用者的责任2．参考文献2.1 ASTM 标准：E1054 实践于评估灭活剂，主要为应用于消毒剂、防腐剂、或腌制产品的抗菌剂2.2 其他文件：试验方法 A ATCC 147-1998 纺织材料抗菌活性评价：平行划线法美国纺织化学家和染色家协会，RTP，NC试验方法 AATCC 100-1999 织物的抗菌整理，美国纺织化学家和染色家协会，RTP，NC3．测试方法概要3.1 固定抗菌剂，如表面复合材料，正常使用条件下不得随意扩散到他们的环境中如 AATCC 147 中的测试方法直接依赖于来自处理过的织物中的抗菌剂的准备浸出能力，这些试验方法用于评估固定化抗菌剂是不合适的下面的试验方法，通过在整个试验过程中试样在细菌悬液中的恒定搅动来确保细菌和处理过的纤维、织物、或其它基质之间有良好的接触这个测试方法适合于评价应力或改良的试样，伴随着适当的控制注 1：应力可能包括洗衣，磨损和磨耗，辐射和蒸汽消毒，紫外照射，溶剂处理，感温性，或类似的物理或化学处理4．意义和使用 4.1 基质抗菌剂的抗菌活性是依赖于与微生物及活性化学剂的直接接触。

此测试通过表面束缚材料样品在浓缩的细菌悬浮液中接触震荡一个小时或由研究者指定的其他接触时间，来确定处理样本的抗菌活性悬浮液在接触和培养之前和之后都被连续的稀释在悬浮液中存活的微生物数量确定和百分比减少量计算，均是基于适当的未经处理的对照组进行的注 2：此方法主要适用于那些在规定的接触时间内，表面有 50％至 100％的活性减少的对象5．设备5.1 灭菌器 ，5.2 培养箱 ，5.3 分光光度仪 ，5.4 手腕式振动器（摇床） ：推荐使用手动式振动器，但其他形式的搅拌如相互式振荡器，同样可以满足常规的测试振荡器必须保证良好的搅拌旋转振动器是不可接受的5.5 水浴槽 ，5.6 旋涡混合器 ，5.7 玻璃器皿 ，5.7.1 混合瓶 ，250ml 锥形瓶中，加盖，高温高压灭菌5.7.2 稀释容器 ，5.7.3 移液管 ，5.8 琼脂 ，孔径为 8 毫米6．试剂6.1 缓冲溶液 ：测试试样中用于改变系统 pH 的溶液，推荐使用 Sorensen 的磷酸盐缓冲液（pH 为 6.8） 2其他的合适的缓冲液必须不能引起细菌数量的减少或增加，在使用中应通过事先浓度测试对于所有的其他样品，建议使用以下溶液，该溶液由试剂级化学品配制。

缓冲库存溶液（0.25M KH 2PO4）：按以下配制方法配制新的溶液，至少每六个月更新一次：称取 34±0.1 克磷酸二氢钾到 100 毫升的烧杯中加入 500 毫升的蒸馏水中用稀的 NaOH 溶液调节 pH值至 7.2±0.1稀释至 1000 毫升，转移到烧瓶中，4℃存储工作缓冲溶液（0.3mm 的 KH2PO4）：按以下方法配制新的溶液，至少每 2 个月更新一次：用无菌移液管移取 1±0.01 毫升库存缓冲溶液溶液，移至含 800 毫升蒸馏水的烧杯中加盖并消毒6.2 介质 ：6.2.1 营养液培养基 （Difco Laboratories, Detroit, MI or equivalent ）或适合于生物体挑选的媒质6.2.2 蛋白胨葡萄糖汁琼脂 （Difco Laboratories, Detroit, MI or equivalent ）或适合于生物体挑选的媒质6.3 润湿剂表面活性剂 ——必须确保不会造成细菌数量减少或增加，在预定使用之前须通过浓度测试注 3：Dow Corning, Midland, MI Q2-5211 在最终溶液稀释 0.01％或等价物可以使用7．试验菌7.1 Klebsiella pneumoniae（佛里德兰德氏杆菌） ，美国典型培养物保藏号4352。

按研究人员的要求可使用其他生物体7.1.1 在常规基础上，测试生物体的培养应保持良好的微生物学实践和纯度检查一致性和准确性测试需要保持纯净、无污染的培养通过良好的无菌技术在接种和转移中的使用，来避免污染通过严格遵守每月的库存转移来避免突变或复归通过定期使用平板划线法并观察的单一品种菌落的特性，来检查培养纯度注 4：光泽度在 Klebsiella pneumoniae（佛里德兰德氏杆菌）肉汤培养物中是复归的一个标志，该培养物不应使用8．参数8.1 所用的好氧微生物和/或接触时间，必须指定8.2 表面预处理或条件必须被指定样品的预处理是为了在预期的时间范围内显示最大活性，因此预处理必须记录并且与相同处理进行对比8.3 试样的重量、尺寸、和材质材料必须被指定8.4 试样应该被准备为可以最大限度地提高搅拌和可记录的比表面积反射，来用于测试浓度8.5 润湿剂表面活性剂必须与高疏水性的样品一起使用9．制备细菌培养液9.1 在无菌营养肉汤，为每个系列的样品培养新鲜的 18 小时 Klebsiella pneumoniae 佛里德兰德氏杆菌 摇瓶培养液如果指定了其他生物体的，它们应以相同的方式制备，除非指定其他的媒质和不同的校准技术。

9.2 用无菌缓冲溶液稀释培养液，直到该溶液在 475 nm 处的吸光度为0.28±0.01，分光光度法测定这时浓度为 1.5-3.0±108 CFU/ml适当稀释到无菌缓冲溶液中，得到的最终浓度为 1.5-3.0×105 CFU/ml最终得到的溶液为所使用的细菌稀释溶液注 5：对于其他生物体，用适当的方法调整终浓度为 1.5-3.0×105 CFU/ml10．样本测试10.1 试验样品的制备：10.1.1 布和纸制品 ——样品的选择基于调查人员要求的重量基础下确定，称重 60.1 克注 6：重量，通常在 0.5 和 2.0 g，必须保证接触时间过程中的强力搅拌标本应削剪成足够小的部分，以确保最大搅拌，同时，处理和未经处理的对照组之间的大小必须相同形成标本负面影响的重现性10.1.2 粉末和颗粒材料 ——称至 60.1 克材料必须在振荡后沉淀，因此，检索和计算技术不会对样品产生干扰10.1.3 其他固体（表面处理） ——减少固体的大小，以适于加入烧瓶中，或使用无菌广口瓶使用的试样有着 9 平方英寸（58 平方厘米）的处理表面积样品的选择也可以在研究人员的考虑下以重量为基础，称重 60.1 克。

剧烈晃动时必须小心实践，不可打破烧瓶或瓶子未经处理的试样固体必须不吸收该溶液测试试样可以包装密封为测试容器，以便接种物直接接触的仅为处理过的表面注 7: 该方法的这个部分的固体预期为塑料，玻璃珠或芯片，陶瓷，金属芯片，或类似的硬质表面11．抗菌活性测定的步骤11.1按第10部分准备抗菌粘接表面样品进行测试要求每个样品的经过处理的一件、每个样品中完全相同的但未经处理的一件用于测试11.2为每个经过处理及未经处理的样品各准备一个无菌250毫升的带螺旋帽的锥形烧瓶，除外再准备一个“仅培养液” 的样品如果一个系列正在运行，为每个试样准备一个烧瓶，同时又为每个类型的试样准备一个烧瓶作为对照给每个烧瓶各加入50±0.1毫升按9.2中配制准备的细菌稀释溶液11.3给烧瓶加盖并将它们放至摇床上用最大速度振荡1分钟±5秒每个烧瓶被认为是一个“0”的接触时间通过连续稀释和标准平板计数技术，在“0” 的时间确定溶液的细菌浓度无系列测试瓶应足够大，在接触后第一个到最后一个连续稀释之间需要超过5分钟注8——对溶液残留抗菌剂的影响额外的保证，可使用中和剂的稀释液详见E105411.4当为“0”的接触时间的子样本已被制备，将测试样和对照样分别放置在各自的烧瓶中。

重新对烧瓶加盖并放置于摇床上一般用最大摇程振荡1小时±5分钟，除非指定一个不同的接触时间立即从每个烧瓶中移取1±0.01ml到一个测试试管中，连续稀释并析出两份作为“0” 的接触时间的循环产物注9——研究者可在任何所需的温度与测试的有机体，和/或样品最终使用的抗菌温度的反射，以及良好的微生物学步骤中，实际运行部分摇瓶步骤注10——样品上残留的细菌滞留可以用适宜的技术如琼脂印记测试或缓冲液提取和平板计数等进行测定11.5允许两个子集的所有培养皿培养24至48小时11.6对培养皿中的细菌群落进行计数记录数值，对重复的培养皿数目计算均值并将均值转换为菌落数单位（CFU/ml ） 如果任意样品的重复计数未在15％以内，则丢弃该样品并重复测试注11——原始测试菌的存在可以通过革兰氏染色和菌株特性在确定11.7接触样品所得的生物体减少量百分比可通过下面的公式计算结果存在于下述两者之一，即通过测量CFU/ml 得到减少百分比，或者通过对细菌密度的对数取均值所得死亡速率减少量，%（CFU/ml）=（B-A ）*100/B死亡速率常数（密度取对数的均值） =B-A其中：A = CFU/毫升（或平均log10的细菌密度） ，烧瓶中含有经过指定的接触时间后处理过的基质；B =“0”的接触时间的CFU/ 毫升（或平均log10的细菌密度） ，烧瓶为用于在添加处理基质之前确定“A”。

11.8含有培养液且仅控制在指定的接触时间（C）之后的烧瓶计数和含有未经处理的且控制在指定的接触时间（D）之后的烧瓶计数，应该是在 15％之内如果不是，则对经过处理的样品（A)进行生物量的减少百分比计算，并与未经处理的对照样（D）直接比较重复上面的公式替代 D为B，并相应提出报告其中：C = CFU/毫升（或平均 log10的细菌密度）,烧瓶中含有经过指定的接触时间后的培养液；D = CFU/毫升（或平均log10的细菌密度）,烧瓶中含有经过指定的接触时间后的未经处理的基质注12——如果没有可供使用的未经处理的对照织物和含有培养液且仅控制在指定的接触时间（C ）之后的烧瓶计数未在原数的 15％的范围内，测试必须重复11.9如果需要得到具体的死亡速率常数，则记录和报告的值最接近的半个百分点或十分之一的平均log 10细菌密度12．确定浸出抗菌存在的步骤12.1样品分析（试验前） ：12.1.1测量存在或不存在的抑制区域，使用AATCC147-1998 12.2上清液分析（后测） ：12.2.1接种胰化蛋白胨葡萄糖提取物琼脂板或琼脂，适用于测试微生物菌苔融合的生物体（1X10 5CFU/ml） ，并使其干燥。

12.2.2在中心孔径为8毫米的琼脂平板上接种，并去掉塞子12.2.3按第10部分准备测试用的样品每个样本都需要一个处理和一个未经处理的12.2.4准备两个含有50毫升的无菌缓冲溶液的无菌250ml烧瓶12.2.5将测试和对照样本放入各自的烧瓶中盖上盖子并放入摇床按11.4中制定的。