第五节 酶的作用机理知识课件知识讲稿.ppt

第四章酶EnzymeEnzyme生物化学 第五节 酶的作用机理一、酶的活性中心二、酶作用的专一性三、酶高效性的作用机理四、酶活性的调节控制和调节酶五、同工酶一、酶的活性中心与必需基团（一）酶的活性中心 酶是生物大分子，相对分子质量很大，而与酶反应的底物一般是相对分子质量较小的分子，有时即使是大分子底物时，反应也是逐步进行的，酶仅与大分子底物中的一小部分作用与底物接触并且发生反应的部位就称为酶的活性中心(active center) 酶的活性中心往往是若干个在一级结构上相距很远，但在空间结构上彼此靠近的氨基酸残基集中在一起形成具有一定空间结构的区域，该区域与底物相结合并将底物转化为产物，对于结合酶来说，辅酶或辅基往往是活性中心的组成成分酶的结构与功能的关系（二）酶活性中心证明方法 1、切除法 对小分子且结构已知的酶多用此法用专一性的酶切除一段肽链后剩余的肽链仍有活性，说明切除的肽链与活性无关，反之，切除的肽链与活性有关酶的活性中心 选用适当的化学试剂与酶蛋白中的氨基酸残基的侧链基团发生反应引起共价结合、氧化或还原等修饰，称之为化学修饰酶分子中可以修饰的基团有：-SH、-OH、咪唑基、氨基、羧基、胍基等，用作修饰的试剂很多，目前已有七十多种，但专一性的修饰剂不多。

活力中心判断方法：某一基团被修饰后，酶的活性显著下降或无活性，可初步判断该基团与酶的活性有关；反之，与酶的活性无关 缺点： 也有可能酶活性部位外的某个氨基酸残基侧链的修饰而影响酶分子的正常空间结构，而导致酶活性的丧失为排除这种可能，常在底物保护下用同一试剂对酶作用，若不能被修饰，说明该基团确实处于活性部位；反之，底物存在下，该基团可被同一试剂修饰，且使酶失活，在则该基团不是活性部位的基团，而是结构基团 2、化学修饰法酶的活性中心 根据修饰剂是否专一性结合酶的活性中心的特定基团，化学修饰可分为： 修饰试剂既可与酶的活性部位的某特异基团结合，又可与酶的非活性部位的同一基团结合，称之为非特异性共价修饰 此法适用于所修饰的基团只存在与活性部位，在非活性部位不存在或极少存在判断标准是： 酶活力的丧失程度与修饰剂的浓度成正比； 底物或竞争性抑制剂保护下可防止修饰剂的抑制作用 （1）非特异性共价共接修饰：酶的活性中心 修饰剂专一性地结合于酶的活性部位的特定基团，使酶失活如：DIFP（二异丙基氟磷酸，结构见P118）可专一性地结合丝氨酸蛋白酶活性部位的丝氨酸OH而使酶失活DIFP一般不与蛋白质反应，也不与含丝氨酸的蛋白酶原或变性的酶反应，只与活性的酶且活性部位含丝氨酸的酶结合。

（2）特异性的共价修饰：酶的活性中心3、X射线衍射法： 把一纯酶的X射线晶体衍射图谱和酶与底物反应后的X-射线图谱相比较，即可确定酶的活性中心 4、亲和标记法： 根据酶与底物能特异性的结合的性质，设计合成一种含反应基团的底物类似物，作为活性部位的标记试剂，它能象底物一样进入酶的活性部位，并以其活泼的化学基团与酶的活性基团的某些特定基团共价结合，使酶失去活性如胰凝乳蛋白酶最适底物为：N-对甲苯磺酰-L-苯丙氨酰乙酯或甲酯，根据此结构设计的亲和标记试剂为：N-对甲苯磺酰-苯丙氨酰氯甲基酮（TPCK），结构见P119其分子中的氯甲基酮部分可使酶的His57烷基化形成酶TPCK衍生物而使酶失活 5、定点诱变法： 通过基因突变的方法研究酶活性中心的必需氨基酸酶的活性中心邻近效应与定向效应变分子间反应为分子内反应l 邻近效应：酶与底物形成中间复合物后使底物之间、酶的催化基团与底物之间相互靠近，提高了反应基团的有效浓度l 定向效应：由于酶的构象作用，底物的反应基团之间、酶与底物的反应基团之间正确取向的效应l 酶把底物分子从溶液中富集出来，使它们固定在活性中心附近，反应基团相互邻近，同时使反应基团的分子轨道以正确方位相互交叠，反应易于发生。

1、底物和酶的邻近效应与定向效应1、底物和酶的邻近效应与定向效应2、底物形变和诱导契合的催化效应3、酸碱催化3、酸碱催化酸碱催化胰凝乳蛋白酶通过酸碱催化使肽键断裂酶分子部分功能基团起瞬时质子供体或质子受体的作用Specificacid-basecatalysisGeneralacid-basecatalysis影响酸碱催化反应速度的两个因素酸碱强度(pK值）组氨酸咪唑基的解离常数为6，在pH6附近给出质子和结合质子能力相同，是最活泼的催化基团给出质子或结合质子的速度咪唑基最快，半寿期小于10-10秒3、酸碱催化酶部分残基侧链作为亲核基团或亲电基团，与底物形成一个反应活性很高的共价中间物 酶亲核基团：Ser-OH，Cys-SH，His-N：底物亲电中心：磷酰基（P=O）酰基（C=O）糖基（Glu-C-OH）4、共价催化金属酶（metalloenzyme): Fe2+、Cu2+、Zn2+、Mn2+、Co3+金属-激活酶（metal-activated enzyme): Na+、K+、Mg2+、Ca2+（1）通过结合底物为反应定向（2）通过自身价数的改变参加氧化还原反应（3）屏蔽底物或酶活性中心的负电荷5、活性中心金属离子的催化作用 疏水环境 介电常数低，加强极性基团间的作用。

电荷环境 在酶活性中心附近，往往有一电荷离子，可稳定过渡态的离子 6、 活性中心的微环境指出上述诸因素，不是同时在一个酶中起作用，也不是一种因素在所有的酶中起作用常见酶的催化机理丝氨酸蛋白酶的作用机理Ser195His 57Asp 102HOCH2OCO -=Active SerHNNCCCHHCH2Ser195His 57Asp 102- OCH2OCOH=NNHCCCHHCH2丝氨酸蛋白酶家族具有类似的Ser-His-Asp催化三联体（电荷中继网）P405组氨酸的咪唑基受pH影响大HNNCCCHHH+pH 6pH 7+HNNHCCCHHInactive+Ser195His 57Asp 102HOCH2OCO -=HNNHCC-HCCH2HAsp102His57Ser195Catalytic TriadCatalytic TriadHHChymotrypsin 顺序式催化反应 A1NCCNHOOCHOCCNCCNH2C COCheck substrate specificityAsp102His57Ser195HHNCCNHOOCHOCCNCCNH2C COFirst Transition StateChymotrypsin 顺序式催化反应 A2HHNCCNHOOCHOCCNCCNH2C COAcyl-Enzyme IntermediateChymotrypsin 顺序式催化反应 A3HN-HCCNHOOCHOCCNCCNH2C COHOHAcyl-Enzyme Water IntermediateChymotrypsin 顺序式催化反应 D1HOOCCNCCNH2C CHSecond Transition StateOHChymotrypsin 顺序式催化反应 D2HOCCNCCNH2C COOH脱酰作用DeacylationHChymotrypsin 顺序式催化反应 D3酶可使用类似的反应基质 O-C N- H O-C O- Peptide bondEster bond OCH3CO NO2Nitrophenol acetateHO NO2 OCH3COHHartley & KilbyChymotrypsin+ H2O硝基酚Nitrophenol醋酸盐Acetate专一性的形成 Trypsin 一族： chymotrypsin, elastase .Serine proteaseSerine protease 催化机制相同 专一性不同 改变专一性结合区可改变基质专一性 Sciencechymotrypsin (Ser189) trypsin (Asp189)演演 化化Ser蛋白酶家族的专一性不同 p408COO-CAsp活性中心的底物结合部位不同，底物专一性也不同。

TrypsinChymotrypsinElastase切 Lys, Arg切 Trp, Phe, Tyr切 Ala, GlyNon-polarpocketDeep and negativelycharged pocketShallow andnon-polarpocket O OCNCCN C C C C NH3+ O OCNCCN C O OCNCCN CH3Divergent evolutionAsp-His-SerAsp-His-SerConvergent evolution分子演化TrypsinChymotrypsinElastaseThrombinPlasminAcetylcholinAcetylcholinesteraseesteraseThyroglobulinThyroglobulin趋趋同演化同演化CNCCHOCCCOOEster bondPeptide bondEvolutionEvolutionMolecularMolecular分解acetylcholineSerine ProteaseSer 族蛋白酶趋异趋异演化演化教宗平反達爾文Wadman (1996) Nature 383 p.753。