第四章反义核酸与核酶.ppt

l第四章第四章 反义核酸与核酶反义核酸与核酶l反义药物反义药物主要内容主要内容一、反义核酸与反义技术一、反义核酸与反义技术一、反义核酸与反义技术一、反义核酸与反义技术uu反义核酸和反义技术概念反义核酸和反义技术概念反义核酸和反义技术概念反义核酸和反义技术概念uu反义核酸的基本原理反义核酸的基本原理反义核酸的基本原理反义核酸的基本原理uu反义核酸的种类反义核酸的种类反义核酸的种类反义核酸的种类uu反义核酸与反义技术的应用反义核酸与反义技术的应用反义核酸与反义技术的应用反义核酸与反义技术的应用二、核酶技术及其应用二、核酶技术及其应用二、核酶技术及其应用二、核酶技术及其应用uu核酶概述核酶概述核酶概述核酶概述uu核酶与核酶与核酶与核酶与RNARNA修复修复修复修复uu核酶技术在临床上的应用核酶技术在临床上的应用核酶技术在临床上的应用核酶技术在临床上的应用uu核酶技术面临的问题核酶技术面临的问题核酶技术面临的问题核酶技术面临的问题反义核酸和反义技术反义核酸和反义技术uu反义核酸反义核酸反义核酸反义核酸(antisense nucleic acid)(antisense nucleic acid) 是一段与靶基因的某段序列是一段与靶基因的某段序列是一段与靶基因的某段序列是一段与靶基因的某段序列互补的天然存在或人工合成的核苷酸序列互补的天然存在或人工合成的核苷酸序列互补的天然存在或人工合成的核苷酸序列互补的天然存在或人工合成的核苷酸序列 它可通过碱基配对与细胞内核酸特异结合形成杂交分子，从而在它可通过碱基配对与细胞内核酸特异结合形成杂交分子，从而在它可通过碱基配对与细胞内核酸特异结合形成杂交分子，从而在它可通过碱基配对与细胞内核酸特异结合形成杂交分子，从而在转录和翻译水平调节靶基因的表达，具有合成方便、序列设计转录和翻译水平调节靶基因的表达，具有合成方便、序列设计转录和翻译水平调节靶基因的表达，具有合成方便、序列设计转录和翻译水平调节靶基因的表达，具有合成方便、序列设计简单、容易修饰、选择性高、亲和力高等特点简单、容易修饰、选择性高、亲和力高等特点简单、容易修饰、选择性高、亲和力高等特点简单、容易修饰、选择性高、亲和力高等特点uu反义核酸技术（反义核酸技术（反义核酸技术（反义核酸技术（antisense nucleic acids technology)antisense nucleic acids technology) 是根据是根据是根据是根据核酸杂交原理设计的，以选择性地抑制特定基因表达为目的的核酸杂交原理设计的，以选择性地抑制特定基因表达为目的的核酸杂交原理设计的，以选择性地抑制特定基因表达为目的的核酸杂交原理设计的，以选择性地抑制特定基因表达为目的的一类核酸研究新技术一类核酸研究新技术一类核酸研究新技术一类核酸研究新技术 包括包括包括包括反义反义反义反义RNA(asRNA)RNA(asRNA)、反义、反义、反义、反义DNA(asDNA) DNA(asDNA) 、核酶、核酶、核酶、核酶(Rz)(Rz)反义核酸的基本原理反义核酸的基本原理uu绝大多数绝大多数绝大多数绝大多数DNADNA由两条碱基互补的单链组成，生物信息以核苷酸由两条碱基互补的单链组成，生物信息以核苷酸由两条碱基互补的单链组成，生物信息以核苷酸由两条碱基互补的单链组成，生物信息以核苷酸不同排列顺序编码在不同排列顺序编码在不同排列顺序编码在不同排列顺序编码在DNADNA链上，基因组形成单顺反子结构链上，基因组形成单顺反子结构链上，基因组形成单顺反子结构链上，基因组形成单顺反子结构uu在在在在DNADNA双链上被转录为双链上被转录为双链上被转录为双链上被转录为RNARNA的链为正义链，与其相对应的链为的链为正义链，与其相对应的链为的链为正义链，与其相对应的链为的链为正义链，与其相对应的链为反义链反义链反义链反义链uu精心设计一段寡核苷酸与正义链互补，一般由精心设计一段寡核苷酸与正义链互补，一般由精心设计一段寡核苷酸与正义链互补，一般由精心设计一段寡核苷酸与正义链互补，一般由7 7到到到到3030个核苷酸组个核苷酸组个核苷酸组个核苷酸组成成成成，，，，将会阻断基因转录；或将含有反义序列的载体导入细胞内，将会阻断基因转录；或将含有反义序列的载体导入细胞内，将会阻断基因转录；或将含有反义序列的载体导入细胞内，将会阻断基因转录；或将含有反义序列的载体导入细胞内，干扰特定基因表达干扰特定基因表达干扰特定基因表达干扰特定基因表达uu利用这一原理可以在基因位点、前体利用这一原理可以在基因位点、前体利用这一原理可以在基因位点、前体利用这一原理可以在基因位点、前体mRNAmRNA、、、、 mRNAmRNA及蛋白水及蛋白水及蛋白水及蛋白水平，通过干扰特定基因功能限制细胞增殖、分化和凋亡平，通过干扰特定基因功能限制细胞增殖、分化和凋亡平，通过干扰特定基因功能限制细胞增殖、分化和凋亡平，通过干扰特定基因功能限制细胞增殖、分化和凋亡反义基因治疗反义基因治疗 DNA DNA RNA RNA 反义RNA 阻断表达 uu利用人工合成的反义利用人工合成的反义利用人工合成的反义利用人工合成的反义RNARNA或或或或DNADNA导入靶细胞，控制细胞导入靶细胞，控制细胞导入靶细胞，控制细胞导入靶细胞，控制细胞的中间阶段使编码蛋白的基因不能转录为的中间阶段使编码蛋白的基因不能转录为的中间阶段使编码蛋白的基因不能转录为的中间阶段使编码蛋白的基因不能转录为mRNA mRNA 或阻断或阻断或阻断或阻断翻译相应蛋白翻译相应蛋白翻译相应蛋白翻译相应蛋白反义技术的两种技术路线反义技术的两种技术路线uu将表达与体内基因或将表达与体内基因或将表达与体内基因或将表达与体内基因或mRNAmRNA互补序列的基因转入体内，使细胞互补序列的基因转入体内，使细胞互补序列的基因转入体内，使细胞互补序列的基因转入体内，使细胞表达与目标基因互补的表达与目标基因互补的表达与目标基因互补的表达与目标基因互补的mRNAmRNA，从而阻断目标基因的表达，从而阻断目标基因的表达，从而阻断目标基因的表达，从而阻断目标基因的表达uu体外合成体外合成体外合成体外合成mRNAmRNA互补的核苷酸类似物，通过静脉注射等途径进互补的核苷酸类似物，通过静脉注射等途径进互补的核苷酸类似物，通过静脉注射等途径进互补的核苷酸类似物，通过静脉注射等途径进入细胞，特异性地与目标入细胞，特异性地与目标入细胞，特异性地与目标入细胞，特异性地与目标mRNAmRNA作用作用作用作用uu以第二种为主来介绍以第二种为主来介绍以第二种为主来介绍以第二种为主来介绍反义核酸的种类反义核酸的种类uu反义反义反义反义RNARNA：一类能与特异：一类能与特异：一类能与特异：一类能与特异mRNAmRNA互补的小分子质量的、可扩散互补的小分子质量的、可扩散互补的小分子质量的、可扩散互补的小分子质量的、可扩散的的的的DNADNA转录物，能够从翻译、转录和核酸复制水平上高度特异转录物，能够从翻译、转录和核酸复制水平上高度特异转录物，能够从翻译、转录和核酸复制水平上高度特异转录物，能够从翻译、转录和核酸复制水平上高度特异地抑制靶基因表达地抑制靶基因表达地抑制靶基因表达地抑制靶基因表达uu反义反义反义反义DNADNA：人工合成一小段反义寡核苷酸，与：人工合成一小段反义寡核苷酸，与：人工合成一小段反义寡核苷酸，与：人工合成一小段反义寡核苷酸，与DNADNA或或或或mRNAmRNA序序序序列互补结合，封闭靶基因表达（列互补结合，封闭靶基因表达（列互补结合，封闭靶基因表达（列互补结合，封闭靶基因表达（ASODNASODN）））） 理论上认为寡核苷酸与其意义链互补，会象理论上认为寡核苷酸与其意义链互补，会象理论上认为寡核苷酸与其意义链互补，会象理论上认为寡核苷酸与其意义链互补，会象“ “封条封条封条封条” ”一样，阻一样，阻一样，阻一样，阻断断断断mRNAmRNA拼接、转录、翻译，下调特定基因表达拼接、转录、翻译，下调特定基因表达拼接、转录、翻译，下调特定基因表达拼接、转录、翻译，下调特定基因表达反义反义RNA的最初发现的最初发现uu反义反义反义反义RNARNA最先发现于原核细胞，是由最先发现于原核细胞，是由最先发现于原核细胞，是由最先发现于原核细胞，是由TomizarnaTomizarna在在在在19811981年对质粒年对质粒年对质粒年对质粒ColE1ColE1复制的研究过程中发现的复制的研究过程中发现的复制的研究过程中发现的复制的研究过程中发现的c-myc基因基因——真核细胞中天然反义真核细胞中天然反义真核细胞中天然反义真核细胞中天然反义RNARNA调节调节调节调节uuc-mycc-myc基因是禽类髓细胞病毒基因是禽类髓细胞病毒基因是禽类髓细胞病毒基因是禽类髓细胞病毒(AMN)MC-29(AMN)MC-29的的的的V-mycV-myc的细胞同的细胞同的细胞同的细胞同源序列，与多种肿瘤发生发展有关源序列，与多种肿瘤发生发展有关源序列，与多种肿瘤发生发展有关源序列，与多种肿瘤发生发展有关uuSaitoSaito等研究发现，等研究发现，等研究发现，等研究发现，c-mycc-myc基因有基因有基因有基因有3 3个外显子，第一个外显子不个外显子，第一个外显子不个外显子，第一个外显子不个外显子，第一个外显子不编码蛋白质，它的序列与第二个外显子互补，通过反义编码蛋白质，它的序列与第二个外显子互补，通过反义编码蛋白质，它的序列与第二个外显子互补，通过反义编码蛋白质，它的序列与第二个外显子互补，通过反义RNARNA与与与与第二个外显子第二个外显子第二个外显子第二个外显子mRNAmRNA的碱基配对而抑制基因表达的碱基配对而抑制基因表达的碱基配对而抑制基因表达的碱基配对而抑制基因表达uu在人在人在人在人BurkittBurkitt淋巴瘤中发现淋巴瘤中发现淋巴瘤中发现淋巴瘤中发现c-mycc-myc基因失去了第一个外显子，从基因失去了第一个外显子，从基因失去了第一个外显子，从基因失去了第一个外显子，从而使而使而使而使c-mycc-myc基因表达失控基因表达失控基因表达失控基因表达失控uu由此可见，反义由此可见，反义由此可见，反义由此可见，反义RNARNA的负调节被解除是细胞恶性转变的原因之的负调节被解除是细胞恶性转变的原因之的负调节被解除是细胞恶性转变的原因之的负调节被解除是细胞恶性转变的原因之一一一一c-myc基因基因——真核细胞中天然反义真核细胞中天然反义真核细胞中天然反义真核细胞中天然反义RNARNA调节调节调节调节c-mycc-myc互补互补互补互补RNARNAC-MYCC-MYC反义反义RNA的作用机制的作用机制uu作用于外显子和内含子的连接区，阻止作用于外显子和内含子的连接区，阻止作用于外显子和内含子的连接区，阻止作用于外显子和内含子的连接区，阻止mRNAmRNA前体的剪接前体的剪接前体的剪接前体的剪接uu反义反义反义反义RNARNA与与与与DNADNA结合时能阻止转录因子与结合时能阻止转录因子与结合时能阻止转录因子与结合时能阻止转录因子与DNADNA的结合，从而阻的结合，从而阻的结合，从而阻的结合，从而阻止特定基因的转录止特定基因的转录止特定基因的转录止特定基因的转录uu互补于特定互补于特定互补于特定互补于特定mRNAmRNA的非编码区，如的非编码区，如的非编码区，如的非编码区，如SDSD序列或核糖体结合位点及序列或核糖体结合位点及序列或核糖体结合位点及序列或核糖体结合位点及其上游区，影响核糖体结合，从而抑制翻译其上游区，影响核糖体结合，从而抑制翻译其上游区，影响核糖体结合，从而抑制翻译其上游区，影响核糖体结合，从而抑制翻译uu互补于特定互补于特定互补于特定互补于特定mRNAmRNA的编码区，抑制翻译或激活的编码区，抑制翻译或激活的编码区，抑制翻译或激活的编码区，抑制翻译或激活RNase HRNase H使使使使mRNAmRNA易被核酸酶降解易被核酸酶降解易被核酸酶降解易被核酸酶降解uu作用于靶作用于靶作用于靶作用于靶mRNAmRNA的的的的5’5’端，阻止帽子结构形成，影响端，阻止帽子结构形成，影响端，阻止帽子结构形成，影响端，阻止帽子结构形成，影响mRNAmRNA的成熟的成熟的成熟的成熟uu作用于作用于作用于作用于PoIy APoIy A形成位点，阻止靶形成位点，阻止靶形成位点，阻止靶形成位点，阻止靶mRNAmRNA成熟及向胞浆内的转运成熟及向胞浆内的转运成熟及向胞浆内的转运成熟及向胞浆内的转运反义反义RNA的作用机制的作用机制DNApreRNARNAProteinm7G5'pppAA…AArRNA反义反义RNA的获得途径的获得途径uu化学会成法化学会成法化学会成法化学会成法：：：：利用核酸合成仪直接合成反义利用核酸合成仪直接合成反义利用核酸合成仪直接合成反义利用核酸合成仪直接合成反义RNARNAuu体外转录法体外转录法体外转录法体外转录法：：：：利用带有噬菌体利用带有噬菌体利用带有噬菌体利用带有噬菌体SP6SP6或或或或T7T7等启动子序列的质粒，等启动子序列的质粒，等启动子序列的质粒，等启动子序列的质粒，将特异基因的将特异基因的将特异基因的将特异基因的DNADNA片段反向插入其多克隆位点中，在片段反向插入其多克隆位点中，在片段反向插入其多克隆位点中，在片段反向插入其多克隆位点中，在RNARNA聚合聚合聚合聚合酶的作用下体外合成特异性反义酶的作用下体外合成特异性反义酶的作用下体外合成特异性反义酶的作用下体外合成特异性反义RNARNAuu细胞内转录法细胞内转录法细胞内转录法细胞内转录法：：：：利用基因重组技术，在适宜启动子和转录终止利用基因重组技术，在适宜启动子和转录终止利用基因重组技术，在适宜启动子和转录终止利用基因重组技术，在适宜启动子和转录终止子之间反向插人一段靶基因，人工构建反义子之间反向插人一段靶基因，人工构建反义子之间反向插人一段靶基因，人工构建反义子之间反向插人一段靶基因，人工构建反义RNARNA表达载体表达载体表达载体表达载体( (病病病病毒表达载体或质粒表达载体毒表达载体或质粒表达载体毒表达载体或质粒表达载体毒表达载体或质粒表达载体) )，然后转染细胞并使之在细胞中稳，然后转染细胞并使之在细胞中稳，然后转染细胞并使之在细胞中稳，然后转染细胞并使之在细胞中稳定表达反义定表达反义定表达反义定表达反义RNARNA反义反义RNA的临床作用的临床作用uu抗病毒：抗病毒：抗病毒：抗病毒：uu将特定的病毒基因反向插入到表达性载体中，以构建反义将特定的病毒基因反向插入到表达性载体中，以构建反义将特定的病毒基因反向插入到表达性载体中，以构建反义将特定的病毒基因反向插入到表达性载体中，以构建反义RNARNA表达载体表达载体表达载体表达载体uu再将重组体导入真核细胞再将重组体导入真核细胞再将重组体导入真核细胞再将重组体导入真核细胞( (病毒宿主细胞病毒宿主细胞病毒宿主细胞病毒宿主细胞) )中表达特异性反义中表达特异性反义中表达特异性反义中表达特异性反义RNARNAuu从而抑制特异有害基因的表达或抑制病毒复制（疱疹病毒、流从而抑制特异有害基因的表达或抑制病毒复制（疱疹病毒、流从而抑制特异有害基因的表达或抑制病毒复制（疱疹病毒、流从而抑制特异有害基因的表达或抑制病毒复制（疱疹病毒、流感病毒、人类免疫缺陷病毒）感病毒、人类免疫缺陷病毒）感病毒、人类免疫缺陷病毒）感病毒、人类免疫缺陷病毒）uu抗肿瘤：抗肿瘤：抗肿瘤：抗肿瘤：uu设计出针对肿瘤细胞的癌基因、突变基因、非正常表达基因及设计出针对肿瘤细胞的癌基因、突变基因、非正常表达基因及设计出针对肿瘤细胞的癌基因、突变基因、非正常表达基因及设计出针对肿瘤细胞的癌基因、突变基因、非正常表达基因及某些肿瘤相关病毒的癌基因反义某些肿瘤相关病毒的癌基因反义某些肿瘤相关病毒的癌基因反义某些肿瘤相关病毒的癌基因反义RNARNAuu以阻断这些有害基因的表达，达到治疗肿瘤的目的以阻断这些有害基因的表达，达到治疗肿瘤的目的以阻断这些有害基因的表达，达到治疗肿瘤的目的以阻断这些有害基因的表达，达到治疗肿瘤的目的反义反义DNA与靶基因结合形式与靶基因结合形式uu寡核苷酸与双股寡核苷酸与双股寡核苷酸与双股寡核苷酸与双股DNADNA结合，形成三股螺旋结构，竞争抑制激活结合，形成三股螺旋结构，竞争抑制激活结合，形成三股螺旋结构，竞争抑制激活结合，形成三股螺旋结构，竞争抑制激活转录蛋白与基因启动子结合，发挥其生物活性转录蛋白与基因启动子结合，发挥其生物活性转录蛋白与基因启动子结合，发挥其生物活性转录蛋白与基因启动子结合，发挥其生物活性uu寡核苷酸与寡核苷酸与寡核苷酸与寡核苷酸与mRNAmRNA杂交形成了核糖核苷酸酶杂交形成了核糖核苷酸酶杂交形成了核糖核苷酸酶杂交形成了核糖核苷酸酶H(RNase H)H(RNase H)底物，底物，底物，底物，激活激活激活激活RNase HRNase H识别杂交体特异性地剪切杂交分子中的识别杂交体特异性地剪切杂交分子中的识别杂交体特异性地剪切杂交分子中的识别杂交体特异性地剪切杂交分子中的mRNAmRNARNase HRNase HASODNASODNmRNAmRNATFO反义寡聚核苷酸与反义寡聚核苷酸与反义寡聚核苷酸与反义寡聚核苷酸与mRNAmRNA特异性结合，特异性结合，特异性结合，特异性结合，阻断翻译过程阻断翻译过程阻断翻译过程阻断翻译过程ANTISENSE ANTISENSE TECHNOLOGIESTECHNOLOGIESGENOMICS BASED GENOMICS BASED DRUG DISCOVERYDRUG DISCOVERYPHARMACEUTICALSPHARMACEUTICALSMOLECULAR MOLECULAR DIAGNOSTICSDIAGNOSTICSGENE THERAPYGENE THERAPYDRUG DELIVERY DRUG DELIVERY SYSTEMSSYSTEMSRelation of antisense technologies to other segments of Relation of antisense technologies to other segments of biopharmaceutical industrybiopharmaceutical industry反义技术与反义核酸的应用反义技术与反义核酸的应用uu利用反义利用反义利用反义利用反义RNARNA的原癌基因失活疗法：的原癌基因失活疗法：的原癌基因失活疗法：的原癌基因失活疗法： 阻止或抑制原癌基因的过度表达及抑制癌基因突变体阻止或抑制原癌基因的过度表达及抑制癌基因突变体阻止或抑制原癌基因的过度表达及抑制癌基因突变体阻止或抑制原癌基因的过度表达及抑制癌基因突变体mRNAmRNA成熟成熟成熟成熟uu原癌基因原癌基因原癌基因原癌基因uu 调控细胞生长，增殖与分化调控细胞生长，增殖与分化调控细胞生长，增殖与分化调控细胞生长，增殖与分化uu 正常情况下，表达受严格控制正常情况下，表达受严格控制正常情况下，表达受严格控制正常情况下，表达受严格控制uu 一旦调节失控，基因产物（生长因子，生长因子受体，胞内外传递信一旦调节失控，基因产物（生长因子，生长因子受体，胞内外传递信一旦调节失控，基因产物（生长因子，生长因子受体，胞内外传递信一旦调节失控，基因产物（生长因子，生长因子受体，胞内外传递信 号等癌蛋白）分泌过剩，细胞恶性增生，致癌号等癌蛋白）分泌过剩，细胞恶性增生，致癌号等癌蛋白）分泌过剩，细胞恶性增生，致癌号等癌蛋白）分泌过剩，细胞恶性增生，致癌uu 治疗方法治疗方法治疗方法治疗方法uu 根据已知癌基因的核苷酸序列合成反义根据已知癌基因的核苷酸序列合成反义根据已知癌基因的核苷酸序列合成反义根据已知癌基因的核苷酸序列合成反义RNARNAuu 相应的反义寡聚核苷酸与肿瘤癌基因活化表达的相应的反义寡聚核苷酸与肿瘤癌基因活化表达的相应的反义寡聚核苷酸与肿瘤癌基因活化表达的相应的反义寡聚核苷酸与肿瘤癌基因活化表达的mRNAmRNA的起始翻译位的起始翻译位的起始翻译位的起始翻译位 点结合成点结合成点结合成点结合成RNA/RNARNA/RNA双链体双链体双链体双链体uu 双链体阻止启动子与核糖体结合，或核糖体沿双链体阻止启动子与核糖体结合，或核糖体沿双链体阻止启动子与核糖体结合，或核糖体沿双链体阻止启动子与核糖体结合，或核糖体沿mRNAmRNA上移，抑制翻译上移，抑制翻译上移，抑制翻译上移，抑制翻译反义反义RNA的应用（一）的应用（一） 反义反义RNA的应用（二）的应用（二） 反义反义RNA的应用（二）的应用（二） 反义反义RNA的应用（二）的应用（二）uu抗抗抗抗HIV-lHIV-l的作用的作用的作用的作用 ：从翻译水平封闭基因表达，并干扰：从翻译水平封闭基因表达，并干扰：从翻译水平封闭基因表达，并干扰：从翻译水平封闭基因表达，并干扰mRNAmRNA的剪切、加工而实的剪切、加工而实的剪切、加工而实的剪切、加工而实现抗病毒作用现抗病毒作用现抗病毒作用现抗病毒作用 uutattat为为为为HIV-lHIV-l重要的调节基因，编码反式激活因子重要的调节基因，编码反式激活因子重要的调节基因，编码反式激活因子重要的调节基因，编码反式激活因子 Tat Tat蛋白蛋白蛋白蛋白uu在逆转录病毒启动子在逆转录病毒启动子在逆转录病毒启动子在逆转录病毒启动子LTRLTR之后连接反义之后连接反义之后连接反义之后连接反义tattat与多聚与多聚与多聚与多聚TARTAR的构建物的构建物的构建物的构建物(LTR-25TAR-(LTR-25TAR-AS-TAT) AS-TAT) ，具有反义，具有反义，具有反义，具有反义tattat及及及及TARTAR诱饵的双重作用诱饵的双重作用诱饵的双重作用诱饵的双重作用uu由于由于由于由于LTRLTR启动子受启动子受启动子受启动子受TatTat蛋白反式激活，使蛋白反式激活，使蛋白反式激活，使蛋白反式激活，使tattat在在在在HIV-lHIV-l感染的细胞中得以高表达感染的细胞中得以高表达感染的细胞中得以高表达感染的细胞中得以高表达uu将这种外源基因导入将这种外源基因导入将这种外源基因导入将这种外源基因导入Molt-3 TMolt-3 T细胞系、细胞系、细胞系、细胞系、CEM-SS TCEM-SS T细胞系及健康人外周血单个细胞系及健康人外周血单个细胞系及健康人外周血单个细胞系及健康人外周血单个核细胞核细胞核细胞核细胞( (PBMCs)PBMCs)，，，，对实验及临床分离病毒株均有抑制作用对实验及临床分离病毒株均有抑制作用对实验及临床分离病毒株均有抑制作用对实验及临床分离病毒株均有抑制作用uugaggag是是是是HIV-1HIV-1的结构基因，编码的结构基因，编码的结构基因，编码的结构基因，编码p24p24等病毒结构蛋白等病毒结构蛋白等病毒结构蛋白等病毒结构蛋白uuVeresVeres等构建了逆转录病毒载体，在细胞内表达互补于等构建了逆转录病毒载体，在细胞内表达互补于等构建了逆转录病毒载体，在细胞内表达互补于等构建了逆转录病毒载体，在细胞内表达互补于gaggag区不同长度的反义区不同长度的反义区不同长度的反义区不同长度的反义RNA(225-1225nt)RNA(225-1225nt) uu在在在在CEM-SS TCEM-SS T细胞及外周血细胞及外周血细胞及外周血细胞及外周血CD4CD4细胞均有抑制细胞均有抑制细胞均有抑制细胞均有抑制HIV-lHIV-l复制的作用复制的作用复制的作用复制的作用uu长片段反义长片段反义长片段反义长片段反义RNARNA的抗的抗的抗的抗HIV-lHIV-l作用更好，可能由于它能与不同种的作用更好，可能由于它能与不同种的作用更好，可能由于它能与不同种的作用更好，可能由于它能与不同种的HIV-l RNAHIV-l RNA结结结结合而限制了病毒的逃逸合而限制了病毒的逃逸合而限制了病毒的逃逸合而限制了病毒的逃逸 部分反义药物部分反义药物针对肿瘤的反义药物针对肿瘤的反义药物针对其他疾病的反义药物针对其他疾病的反义药物第一个反义药物第一个反义药物——福米韦生福米韦生uuFomivirsenFomivirsen（（（（ISIS2922ISIS2922）是）是）是）是FDAFDA批准上市的第批准上市的第批准上市的第批准上市的第1 1个反义药物个反义药物个反义药物个反义药物uu商品名商品名商品名商品名VitraveneVitraveneuu美国美国美国美国ISIS PharmaISIS Pharma公司研制公司研制公司研制公司研制uu瑞士瑞士瑞士瑞士Ciba Vision OphthalmicsCiba Vision Ophthalmics公司申请公司申请公司申请公司申请uu19981998年年年年8 8月在美国首次上市月在美国首次上市月在美国首次上市月在美国首次上市uu核苷酸序列为核苷酸序列为核苷酸序列为核苷酸序列为5’- GCGTTTGCTCTTCTTCTTGCG-3’5’- GCGTTTGCTCTTCTTCTTGCG-3’uu硫代磷酸化修饰硫代磷酸化修饰硫代磷酸化修饰硫代磷酸化修饰uu主要用于治疗艾滋病主要用于治疗艾滋病主要用于治疗艾滋病主要用于治疗艾滋病(AIDS)(AIDS)病人并发的巨细胞病毒病人并发的巨细胞病毒病人并发的巨细胞病毒病人并发的巨细胞病毒(CMV)(CMV)性视网膜炎性视网膜炎性视网膜炎性视网膜炎第一个反义药物第一个反义药物——福米韦生福米韦生uu1 1 药效学药效学药效学药效学uu1.1 1.1 抗病毒作用机制抗病毒作用机制抗病毒作用机制抗病毒作用机制 主要依赖于反义作用，福米韦生与主要依赖于反义作用，福米韦生与主要依赖于反义作用，福米韦生与主要依赖于反义作用，福米韦生与CMV mRNACMV mRNA特异序列互补结合，特异序列互补结合，特异序列互补结合，特异序列互补结合，被被被被RNARNA酶酶酶酶H H识别，并使识别，并使识别，并使识别，并使mRNAmRNA水解失活水解失活水解失活水解失活 抑制抑制抑制抑制CMVCMV进入宿主细胞是序列非依赖性的非反义作用进入宿主细胞是序列非依赖性的非反义作用进入宿主细胞是序列非依赖性的非反义作用进入宿主细胞是序列非依赖性的非反义作用uu1.2 1.2 抗病毒活性抗病毒活性抗病毒活性抗病毒活性 对人类对人类对人类对人类CMVCMV病毒株病毒株病毒株病毒株AD169AD169的的的的EC50EC50为为为为0.37μmoL0.37μmoL 此此此此EC50EC50为更昔洛韦（为更昔洛韦（为更昔洛韦（为更昔洛韦（ganciclovirganciclovir）的）的）的）的l30l30～～～～190190uu1.3 1.3 耐药性耐药性耐药性耐药性 耐受高浓度福米韦生的病毒突变株与福米韦生互补的基因区并无改变，耐受高浓度福米韦生的病毒突变株与福米韦生互补的基因区并无改变，耐受高浓度福米韦生的病毒突变株与福米韦生互补的基因区并无改变，耐受高浓度福米韦生的病毒突变株与福米韦生互补的基因区并无改变，这表明耐药性不是互补基因区发生改变而引起的这表明耐药性不是互补基因区发生改变而引起的这表明耐药性不是互补基因区发生改变而引起的这表明耐药性不是互补基因区发生改变而引起的第一个反义药物第一个反义药物——福米韦生福米韦生uu2 2 药动学药动学药动学药动学uu2.1 2.1 兔体内药动学兔体内药动学兔体内药动学兔体内药动学uu以以以以1414C C标记的福米韦生单次标记的福米韦生单次标记的福米韦生单次标记的福米韦生单次6666μμμμg g剂量，玻璃体液中消除剂量，玻璃体液中消除剂量，玻璃体液中消除剂量，玻璃体液中消除t1/2t1/2为为为为62h62huu给药给药给药给药1010天后，仍对天后，仍对天后，仍对天后，仍对CMVCMV复制有抑制作用，有复制有抑制作用，有复制有抑制作用，有复制有抑制作用，有22%22%的福米韦生存在，其的福米韦生存在，其的福米韦生存在，其的福米韦生存在，其余余余余78%78%则降解为短链代谢物则降解为短链代谢物则降解为短链代谢物则降解为短链代谢物uu视网膜中消除视网膜中消除视网膜中消除视网膜中消除t1/2t1/2约为约为约为约为79h79huu2.2 2.2 猴体内药动学猴体内药动学猴体内药动学猴体内药动学uu玻璃体液药物浓度与剂量曲线几乎为直线关系玻璃体液药物浓度与剂量曲线几乎为直线关系玻璃体液药物浓度与剂量曲线几乎为直线关系玻璃体液药物浓度与剂量曲线几乎为直线关系uu峰值浓度出现在给药峰值浓度出现在给药峰值浓度出现在给药峰值浓度出现在给药2 2～～～～3 3天后，天后，天后，天后，1414天后基本检测不到天后基本检测不到天后基本检测不到天后基本检测不到uu在每周或每在每周或每在每周或每在每周或每2 2周玻璃体内注入周玻璃体内注入周玻璃体内注入周玻璃体内注入1111、、、、5757和和和和115μg115μg后，玻璃体液中未发现药后，玻璃体液中未发现药后，玻璃体液中未发现药后，玻璃体液中未发现药物累积现象物累积现象物累积现象物累积现象uu但多次注射后，视网膜上出现药物累积现象但多次注射后，视网膜上出现药物累积现象但多次注射后，视网膜上出现药物累积现象但多次注射后，视网膜上出现药物累积现象uu福米韦生福米韦生福米韦生福米韦生115μg115μg单次给药，在视网膜中消除单次给药，在视网膜中消除单次给药，在视网膜中消除单次给药，在视网膜中消除t1/2t1/2为为为为78h78h第一个反义药物第一个反义药物——福米韦生福米韦生uu3 3 临床疗效临床疗效临床疗效临床疗效uu前前前前3 3周每周福米韦生周每周福米韦生周每周福米韦生周每周福米韦生165μg165μg玻璃体内注射，以后每玻璃体内注射，以后每玻璃体内注射，以后每玻璃体内注射，以后每2 2周给药周给药周给药周给药1 1次，用药组次，用药组次，用药组次，用药组和对照组病情进展时间中位数分别为和对照组病情进展时间中位数分别为和对照组病情进展时间中位数分别为和对照组病情进展时间中位数分别为7171和和和和1414天天天天uu福米韦生可以降低病人体内的福米韦生可以降低病人体内的福米韦生可以降低病人体内的福米韦生可以降低病人体内的CMVCMV活性，呈剂量活性，呈剂量活性，呈剂量活性，呈剂量- -效应关系效应关系效应关系效应关系uu病情发展到威胁视力的病人，使用福米韦生后症状有所好转，病情进病情发展到威胁视力的病人，使用福米韦生后症状有所好转，病情进病情发展到威胁视力的病人，使用福米韦生后症状有所好转，病情进病情发展到威胁视力的病人，使用福米韦生后症状有所好转，病情进展明显延缓展明显延缓展明显延缓展明显延缓uu4 4 不良反应不良反应不良反应不良反应uu最常见不良反应是暂时性眼内压升高和轻、中度眼前、后房炎症反应最常见不良反应是暂时性眼内压升高和轻、中度眼前、后房炎症反应最常见不良反应是暂时性眼内压升高和轻、中度眼前、后房炎症反应最常见不良反应是暂时性眼内压升高和轻、中度眼前、后房炎症反应uu所有研究对象均未发生视网膜剥脱和全身毒性反应所有研究对象均未发生视网膜剥脱和全身毒性反应所有研究对象均未发生视网膜剥脱和全身毒性反应所有研究对象均未发生视网膜剥脱和全身毒性反应uu高剂量可引起少数病人外周视网膜色素沉着及周边视力下降高剂量可引起少数病人外周视网膜色素沉着及周边视力下降高剂量可引起少数病人外周视网膜色素沉着及周边视力下降高剂量可引起少数病人外周视网膜色素沉着及周边视力下降uu与眼外科手术相比，玻璃体内注射发生出血、眼内炎和视网膜剥脱的与眼外科手术相比，玻璃体内注射发生出血、眼内炎和视网膜剥脱的与眼外科手术相比，玻璃体内注射发生出血、眼内炎和视网膜剥脱的与眼外科手术相比，玻璃体内注射发生出血、眼内炎和视网膜剥脱的风险要小得多风险要小得多风险要小得多风险要小得多第一个反义药物第一个反义药物——福米韦生福米韦生uu5 5 适应证和禁忌证适应证和禁忌证适应证和禁忌证适应证和禁忌证uu福米韦生为二线治疗药物，适用于对其他治疗措施不能耐受或没有效福米韦生为二线治疗药物，适用于对其他治疗措施不能耐受或没有效福米韦生为二线治疗药物，适用于对其他治疗措施不能耐受或没有效福米韦生为二线治疗药物，适用于对其他治疗措施不能耐受或没有效果或有禁忌的病人；禁用于果或有禁忌的病人；禁用于果或有禁忌的病人；禁用于果或有禁忌的病人；禁用于2 2～～～～4 4周内使用西多福韦（周内使用西多福韦（周内使用西多福韦（周内使用西多福韦（cidofovircidofovir）治疗）治疗）治疗）治疗的病人，以免增加发生眼内炎的危险性的病人，以免增加发生眼内炎的危险性的病人，以免增加发生眼内炎的危险性的病人，以免增加发生眼内炎的危险性uu6 6 与治疗与治疗与治疗与治疗CMVCMV视网膜炎的其他药物比较视网膜炎的其他药物比较视网膜炎的其他药物比较视网膜炎的其他药物比较uu更昔洛韦、西多福韦和膦甲酸钠是更昔洛韦、西多福韦和膦甲酸钠是更昔洛韦、西多福韦和膦甲酸钠是更昔洛韦、西多福韦和膦甲酸钠是CMVCMV抑制剂，而非杀死剂；具有交抑制剂，而非杀死剂；具有交抑制剂，而非杀死剂；具有交抑制剂，而非杀死剂；具有交叉耐药性；可产生肾毒性；插管给药、植入制剂费用昂贵、重复手术叉耐药性；可产生肾毒性；插管给药、植入制剂费用昂贵、重复手术叉耐药性；可产生肾毒性；插管给药、植入制剂费用昂贵、重复手术叉耐药性；可产生肾毒性；插管给药、植入制剂费用昂贵、重复手术以及视网膜剥脱发生率高（以及视网膜剥脱发生率高（以及视网膜剥脱发生率高（以及视网膜剥脱发生率高（28%28%）使应用受限）使应用受限）使应用受限）使应用受限uu福米韦生具有阻止病毒复制，疗效持久、用药次数少，不良反应少而福米韦生具有阻止病毒复制，疗效持久、用药次数少，不良反应少而福米韦生具有阻止病毒复制，疗效持久、用药次数少，不良反应少而福米韦生具有阻止病毒复制，疗效持久、用药次数少，不良反应少而轻，局部玻璃体内注射给药优于其他上述提及的给药方法轻，局部玻璃体内注射给药优于其他上述提及的给药方法轻，局部玻璃体内注射给药优于其他上述提及的给药方法轻，局部玻璃体内注射给药优于其他上述提及的给药方法uu7 7 展望展望展望展望受体介导的转移技术受体介导的转移技术uu受体介导受体介导受体介导受体介导DNADNA转运技术的启发实现转运技术的启发实现转运技术的启发实现转运技术的启发实现DNADNA和和和和RNARNA的转运的转运的转运的转运uu例：脱唾液酸血清类粘蛋白例：脱唾液酸血清类粘蛋白例：脱唾液酸血清类粘蛋白例：脱唾液酸血清类粘蛋白(ASGP)(ASGP)受体受体受体受体 唾液酸血清类粘蛋白唾液酸血清类粘蛋白唾液酸血清类粘蛋白唾液酸血清类粘蛋白 — — 唾液酸唾液酸唾液酸唾液酸 → → → → ASGPASGP ASGPASGP + PL + PL （多聚赖氨酸）（多聚赖氨酸）（多聚赖氨酸）（多聚赖氨酸）→→→→ ASGP-PLASGP-PL复合物复合物复合物复合物 反义反义反义反义RNARNA + ASGP-PL+ ASGP-PL复合物复合物复合物复合物 →→→→ ASGP-PL-ASGP-PL-反义反义反义反义RNARNA复合物复合物复合物复合物 ASGP-PL-ASGP-PL-反义反义反义反义RNARNA复合物复合物复合物复合物 →→→→ 肝细胞表面肝细胞表面肝细胞表面肝细胞表面ASGPASGP受体识别受体识别受体识别受体识别→→→→ 吞噬吞噬吞噬吞噬 →→→→ 释放释放释放释放 → → → → 发挥作用发挥作用发挥作用发挥作用uu优点：优点：优点：优点：专一性强，抗降解能力强专一性强，抗降解能力强专一性强，抗降解能力强专一性强，抗降解能力强以聚合物微球为载体的输送系统以聚合物微球为载体的输送系统 u目前研究最多的聚合物微球是聚丙交酯及乳酸一羟乙酸（目前研究最多的聚合物微球是聚丙交酯及乳酸一羟乙酸（LA-GA））u以丙交酯和乙交酯为单体形成的共聚物，降解属于水解反应以丙交酯和乙交酯为单体形成的共聚物，降解属于水解反应u产物均为人体正常代谢物，降解时间取决于两种单体的配比和产物均为人体正常代谢物，降解时间取决于两种单体的配比和聚合物的分子量聚合物的分子量u构成的结合复合体具有潜在的转运反义核苷酸和核酶的作用构成的结合复合体具有潜在的转运反义核苷酸和核酶的作用 核酶技术及其应用核酶技术及其应用uu核酶核酶核酶核酶(Ribozyme)(Ribozyme) —— ——一种具有核酸内切酶活性的一种具有核酸内切酶活性的一种具有核酸内切酶活性的一种具有核酸内切酶活性的RNARNA分子分子分子分子，可特，可特，可特，可特异性地切割靶异性地切割靶异性地切割靶异性地切割靶RNARNA序列，具有解离后重复切割相同靶序列，具有解离后重复切割相同靶序列，具有解离后重复切割相同靶序列，具有解离后重复切割相同靶分子的能力分子的能力分子的能力分子的能力核酶发展简史核酶发展简史uu19681968年，年，年，年，Francis CrickFrancis Crick在他的论文在他的论文在他的论文在他的论文“ “基因密码的起源基因密码的起源基因密码的起源基因密码的起源” ”一文中提到：一文中提到：一文中提到：一文中提到：“ “可能第一个酶是具有复制能力的可能第一个酶是具有复制能力的可能第一个酶是具有复制能力的可能第一个酶是具有复制能力的RNA”RNA” ，没有人予以注意，没有人予以注意，没有人予以注意，没有人予以注意uu19871987年，第年，第年，第年，第5252届冷泉港定量生物学国际讨论会上，届冷泉港定量生物学国际讨论会上，届冷泉港定量生物学国际讨论会上，届冷泉港定量生物学国际讨论会上，Alan Alan WeinerWeiner做会议总结时重复了做会议总结时重复了做会议总结时重复了做会议总结时重复了2020年前年前年前年前Francis CrickFrancis Crick的话，的话，的话，的话，会议注意力已集中到最近发现的具有酶活性会议注意力已集中到最近发现的具有酶活性会议注意力已集中到最近发现的具有酶活性会议注意力已集中到最近发现的具有酶活性RNARNA分子上分子上分子上分子上uu19891989年，诺贝尔化学奖授予了分别独立地发现具有酶活年，诺贝尔化学奖授予了分别独立地发现具有酶活年，诺贝尔化学奖授予了分别独立地发现具有酶活年，诺贝尔化学奖授予了分别独立地发现具有酶活性的性的性的性的RNARNA分子的分子的分子的分子的Thomas. R. CechThomas. R. Cech（（（（Colorado Colorado UniversityUniversity）））） Sidney AltmanSidney Altman（（（（Yale UniversityYale University））））Thomas R. Cechuu切赫，美国人切赫，美国人切赫，美国人切赫，美国人uu因发现因发现因发现因发现RNARNA生物催化作用与生物催化作用与生物催化作用与生物催化作用与S. AltmanS. Altman同获同获同获同获19891989年诺贝尔化学奖年诺贝尔化学奖年诺贝尔化学奖年诺贝尔化学奖uu独立发现独立发现独立发现独立发现RNARNA不仅被动地传递遗传信不仅被动地传递遗传信不仅被动地传递遗传信不仅被动地传递遗传信息，还能催化细胞内生命所必需的化息，还能催化细胞内生命所必需的化息，还能催化细胞内生命所必需的化息，还能催化细胞内生命所必需的化学反应，学反应，学反应，学反应，19821982年公布其研究结果，年公布其研究结果，年公布其研究结果，年公布其研究结果，19831983年证实年证实年证实年证实RNARNA的酶活动的酶活动的酶活动的酶活动uu此前，人们认为仅蛋白质才能起酶的作此前，人们认为仅蛋白质才能起酶的作此前，人们认为仅蛋白质才能起酶的作此前，人们认为仅蛋白质才能起酶的作用用用用核酶的发现核酶的发现uu研究目的：研究目的：研究目的：研究目的：r rRNARNA中一些无意义的序列，或中一些无意义的序列，或中一些无意义的序列，或中一些无意义的序列，或内含子内含子内含子内含子(intron)(intron)，如何从，如何从，如何从，如何从RNARNA分子中剪切下来？分子中剪切下来？分子中剪切下来？分子中剪切下来？uu研究对象：研究对象：研究对象：研究对象：原生动物四膜虫原生动物四膜虫原生动物四膜虫原生动物四膜虫( (Tetrahymena ThermophilaTetrahymena Thermophila) )，只含一种，只含一种，只含一种，只含一种RNARNA，除，除，除，除rRNArRNA外还有一个由外还有一个由外还有一个由外还有一个由413413个核苷酸组成的插入序列个核苷酸组成的插入序列个核苷酸组成的插入序列个核苷酸组成的插入序列(interveningsequenc(interveningsequenc，，，，IVS)IVS)uu研究发现：研究发现：研究发现：研究发现：转录产物转录产物转录产物转录产物rRNArRNA前体很不稳定，在鸟苷和前体很不稳定，在鸟苷和前体很不稳定，在鸟苷和前体很不稳定，在鸟苷和Mg2+Mg2+存在下切除存在下切除存在下切除存在下切除自身的自身的自身的自身的IVSIVS，，，，使两个外显子拼接起来，变成成熟的使两个外显子拼接起来，变成成熟的使两个外显子拼接起来，变成成熟的使两个外显子拼接起来，变成成熟的rRNArRNA分子。

催化反分子催化反分子催化反分子催化反应是在无任何蛋白质酶存在下发生的，称为应是在无任何蛋白质酶存在下发生的，称为应是在无任何蛋白质酶存在下发生的，称为应是在无任何蛋白质酶存在下发生的，称为自我剪接自我剪接自我剪接自我剪接uu研究结论：研究结论：研究结论：研究结论： I IVSVS具有类似蛋白酶的功能，能够打断及重建磷酸二脂键具有类似蛋白酶的功能，能够打断及重建磷酸二脂键具有类似蛋白酶的功能，能够打断及重建磷酸二脂键具有类似蛋白酶的功能，能够打断及重建磷酸二脂键 r rRNARNA前体能靠自己完成剪接过程前体能靠自己完成剪接过程前体能靠自己完成剪接过程前体能靠自己完成剪接过程，，，，在一定条件下按一定方式盘绕，进在一定条件下按一定方式盘绕，进在一定条件下按一定方式盘绕，进在一定条件下按一定方式盘绕，进而切割自己，以后再把保留部分连接起来可以催化自由底物的具有酶而切割自己，以后再把保留部分连接起来可以催化自由底物的具有酶而切割自己，以后再把保留部分连接起来可以催化自由底物的具有酶而切割自己，以后再把保留部分连接起来。

可以催化自由底物的具有酶活性的活性的活性的活性的RNARNA RNA RNA分子具有自身断裂的催化作用，以及酶活性的另一个重要方面即分子具有自身断裂的催化作用，以及酶活性的另一个重要方面即分子具有自身断裂的催化作用，以及酶活性的另一个重要方面即分子具有自身断裂的催化作用，以及酶活性的另一个重要方面即催化其他分子的反应催化其他分子的反应催化其他分子的反应催化其他分子的反应Sidney Altman uu奥尔特曼（奥尔特曼（奥尔特曼（奥尔特曼（1939—1939—）））） 美国人美国人美国人美国人uu因发现因发现因发现因发现RNARNA的生物催化作用而获的生物催化作用而获的生物催化作用而获的生物催化作用而获19891989年诺贝尔化学奖年诺贝尔化学奖年诺贝尔化学奖年诺贝尔化学奖uu19781978年奥尔特曼发现了核糖核酸年奥尔特曼发现了核糖核酸年奥尔特曼发现了核糖核酸年奥尔特曼发现了核糖核酸(RNA)(RNA)自身具有的生物催化作用自身具有的生物催化作用自身具有的生物催化作用自身具有的生物催化作用uu不仅为探索不仅为探索不仅为探索不仅为探索RNARNA的复制能力提供了的复制能力提供了的复制能力提供了的复制能力提供了线索，而且说明了最早的生命物质是线索，而且说明了最早的生命物质是线索，而且说明了最早的生命物质是线索，而且说明了最早的生命物质是同时具有生物催化功能和遗传功能的同时具有生物催化功能和遗传功能的同时具有生物催化功能和遗传功能的同时具有生物催化功能和遗传功能的RNARNA，打破了蛋白质是生物起源的，打破了蛋白质是生物起源的，打破了蛋白质是生物起源的，打破了蛋白质是生物起源的定论定论定论定论S.Altman的研究工作的研究工作uu研究目的：研究目的：研究目的：研究目的：t-RNAt-RNA分子的剪接过程分子的剪接过程分子的剪接过程分子的剪接过程 uu研究发现：研究发现：研究发现：研究发现：在较高浓度的镁离子和适量精氨酸参与下，核酸酶在较高浓度的镁离子和适量精氨酸参与下，核酸酶在较高浓度的镁离子和适量精氨酸参与下，核酸酶在较高浓度的镁离子和适量精氨酸参与下，核酸酶P P（（（（ribonuclease Pribonuclease P，，，， RNase P RNase P ）中）中）中）中 RNARNA能够切割能够切割能够切割能够切割tRNAtRNA前体前体前体前体5’5’端端端端 uu研究结论：研究结论：研究结论：研究结论：过去都认为过去都认为过去都认为过去都认为RNaseRNase P P的催化作用由的催化作用由的催化作用由的催化作用由RNARNA和蛋白质共同完和蛋白质共同完和蛋白质共同完和蛋白质共同完成的，而该实验证明，成的，而该实验证明，成的，而该实验证明，成的，而该实验证明， RNaseRNase P P的催化作用是由的催化作用是由的催化作用是由的催化作用是由RNARNA完成的，而其中完成的，而其中完成的，而其中完成的，而其中的蛋白质在细胞内仅仅起稳定构象的作用的蛋白质在细胞内仅仅起稳定构象的作用的蛋白质在细胞内仅仅起稳定构象的作用的蛋白质在细胞内仅仅起稳定构象的作用uu由于由于由于由于这类酶这类酶这类酶这类酶具有类似核糖核酸功能，而化学本质为核酸，具有类似核糖核酸功能，而化学本质为核酸，具有类似核糖核酸功能，而化学本质为核酸，具有类似核糖核酸功能，而化学本质为核酸，因此被切赫称之为因此被切赫称之为因此被切赫称之为因此被切赫称之为核酶核酶核酶核酶核酶的作用机制核酶的作用机制 核酶的分类核酶的分类uu剪切型核酶：这类核酶催化自身或者异体剪切型核酶：这类核酶催化自身或者异体剪切型核酶：这类核酶催化自身或者异体剪切型核酶：这类核酶催化自身或者异体RNARNA的切割，相的切割，相的切割，相的切割，相当于核酸内切酶当于核酸内切酶当于核酸内切酶当于核酸内切酶uu剪接型核酶：这类核酶具有核酸内切酶和连接酶两种活性剪接型核酶：这类核酶具有核酸内切酶和连接酶两种活性剪接型核酶：这类核酶具有核酸内切酶和连接酶两种活性剪接型核酶：这类核酶具有核酸内切酶和连接酶两种活性剪切型核酶剪切型核酶剪切型核酶剪切型核酶剪接型核酶剪接型核酶剪接型核酶剪接型核酶根据催化反应根据催化反应根据催化反应根据催化反应锤头核酶锤头核酶锤头核酶锤头核酶I I型内含子型内含子型内含子型内含子IIII型内含子型内含子型内含子型内含子发夹核酶发夹核酶发夹核酶发夹核酶丁型肝炎病毒丁型肝炎病毒丁型肝炎病毒丁型肝炎病毒(HDV)(HDV)核酶核酶核酶核酶RNase PRNase P链孢霉线粒体链孢霉线粒体链孢霉线粒体链孢霉线粒体(VS)(VS)核酶核酶核酶核酶自体催化自体催化自体催化自体催化异体催化异体催化异体催化异体催化自体剪切型核酶自体剪切型核酶-锤头型核酶锤头型核酶uu锤头核酶是从类病毒中分离出来的锤头核酶是从类病毒中分离出来的锤头核酶是从类病毒中分离出来的锤头核酶是从类病毒中分离出来的uu本来是一个顺式切割的酶，将其分为酶链和底物链两部本来是一个顺式切割的酶，将其分为酶链和底物链两部本来是一个顺式切割的酶，将其分为酶链和底物链两部本来是一个顺式切割的酶，将其分为酶链和底物链两部分后就转变为靶标特异性的反式切割的酶分后就转变为靶标特异性的反式切割的酶分后就转变为靶标特异性的反式切割的酶分后就转变为靶标特异性的反式切割的酶uu在防止有害基因的表达上具有很大的应用价值在防止有害基因的表达上具有很大的应用价值在防止有害基因的表达上具有很大的应用价值在防止有害基因的表达上具有很大的应用价值uu形状：长约形状：长约形状：长约形状：长约3030个核苷酸，呈球状构象，可粗略看成个核苷酸，呈球状构象，可粗略看成个核苷酸，呈球状构象，可粗略看成个核苷酸，呈球状构象，可粗略看成   性折性折性折性折叠叠叠叠uu二级结构：二级结构：二级结构：二级结构：3 3个超螺旋结构域和个超螺旋结构域和个超螺旋结构域和个超螺旋结构域和1 13 3个保守核苷酸残基个保守核苷酸残基个保守核苷酸残基个保守核苷酸残基uu构成：催化区和底物结合区构成：催化区和底物结合区构成：催化区和底物结合区构成：催化区和底物结合区uu性质：需要二价金属离子性质：需要二价金属离子性质：需要二价金属离子性质：需要二价金属离子( (Mg2+)Mg2+)作为它的辅因子，核酶作为它的辅因子，核酶作为它的辅因子，核酶作为它的辅因子，核酶的活性形式是一种的活性形式是一种的活性形式是一种的活性形式是一种RNARNA键合金属氢氧化物键合金属氢氧化物键合金属氢氧化物键合金属氢氧化物uu3 3个双螺旋区个双螺旋区个双螺旋区个双螺旋区uu1313个核苷酸残基保守序列个核苷酸残基保守序列个核苷酸残基保守序列个核苷酸残基保守序列uu剪切反应在右上方剪切反应在右上方剪切反应在右上方剪切反应在右上方GUXGUX序列的序列的序列的序列的3‘3‘端自动发生端自动发生端自动发生端自动发生发夹结构核酶发夹结构核酶uu19891989年汉普（年汉普（年汉普（年汉普（HampleHample）研究烟草环斑病毒（）研究烟草环斑病毒（）研究烟草环斑病毒（）研究烟草环斑病毒（sTRSVsTRSV））））的负链的负链的负链的负链RNARNA的自我剪切反应，提出发夹结构（的自我剪切反应，提出发夹结构（的自我剪切反应，提出发夹结构（的自我剪切反应，提出发夹结构（hairpin hairpin structurestructure）模型）模型）模型）模型uu发夹核酶催化机制：金属离子在催化反应中起结构作用，发夹核酶催化机制：金属离子在催化反应中起结构作用，发夹核酶催化机制：金属离子在催化反应中起结构作用，发夹核酶催化机制：金属离子在催化反应中起结构作用，其剪切活性比锤头结构核酶高其剪切活性比锤头结构核酶高其剪切活性比锤头结构核酶高其剪切活性比锤头结构核酶高5‘3‘剪切位点剪切位点剪切位点剪切位点自体剪切型核酶自体剪切型核酶-发夹结构发夹结构uu3 3个环和个环和个环和个环和4 4个螺旋形成两个结构域个螺旋形成两个结构域个螺旋形成两个结构域个螺旋形成两个结构域uu剪切反应发生在底物识别序列剪切反应发生在底物识别序列剪切反应发生在底物识别序列剪切反应发生在底物识别序列GUCGUC的的的的5‘5‘端端端端uu两个内部环中的碱基及在螺旋区两个内部环中的碱基及在螺旋区两个内部环中的碱基及在螺旋区两个内部环中的碱基及在螺旋区IIII的的的的G11G11和底物中的和底物中的和底物中的和底物中的G+1G+1都是酶发挥都是酶发挥都是酶发挥都是酶发挥作用所必需的作用所必需的作用所必需的作用所必需的肝炎病毒（肝炎病毒（HDV）核酶）核酶uu目前唯一一种哺乳动物细胞内具有天然核酶活性的动物目前唯一一种哺乳动物细胞内具有天然核酶活性的动物目前唯一一种哺乳动物细胞内具有天然核酶活性的动物目前唯一一种哺乳动物细胞内具有天然核酶活性的动物病毒病毒病毒病毒uu来源于肝炎病毒的反义来源于肝炎病毒的反义来源于肝炎病毒的反义来源于肝炎病毒的反义RNARNA和基因组和基因组和基因组和基因组RNARNA，为单股环状，为单股环状，为单股环状，为单股环状负链负链负链负链RNARNA病毒病毒病毒病毒uu结构特点：有结构特点：有结构特点：有结构特点：有3 3个由碱基配对形成的茎，剪切时需要二个由碱基配对形成的茎，剪切时需要二个由碱基配对形成的茎，剪切时需要二个由碱基配对形成的茎，剪切时需要二价阳离子参与，结果产生价阳离子参与，结果产生价阳离子参与，结果产生价阳离子参与，结果产生5‘-OH5‘-OH和和和和 2’, 3’-2’, 3’-环磷酸环磷酸环磷酸环磷酸剪切部位剪切部位剪切部位剪切部位剪切部位剪切部位剪切部位剪切部位自体剪切型核酶自体剪切型核酶-斧头结构斧头结构uu三个碱基对的茎三个碱基对的茎三个碱基对的茎三个碱基对的茎uu需要二价阳离子需要二价阳离子需要二价阳离子需要二价阳离子uu产生产生产生产生5’-OH5’-OH和和和和 2’,3’-2’,3’-环环环环磷酸磷酸磷酸磷酸链孢霉线粒体（链孢霉线粒体（VS）核酶）核酶uuVSVS核酶球状，由核酶球状，由核酶球状，由核酶球状，由5 5个螺旋结构组成，这些螺旋结构通过个螺旋结构组成，这些螺旋结构通过个螺旋结构组成，这些螺旋结构通过个螺旋结构组成，这些螺旋结构通过两个连接域连接起来，连接域对于催化反应很重要两个连接域连接起来，连接域对于催化反应很重要两个连接域连接起来，连接域对于催化反应很重要两个连接域连接起来，连接域对于催化反应很重要异体剪切型核酶－异体剪切型核酶－RNase PuuRNase PRNase P是内切核酸酶，是核糖核蛋白体复合物，能剪切是内切核酸酶，是核糖核蛋白体复合物，能剪切是内切核酸酶，是核糖核蛋白体复合物，能剪切是内切核酸酶，是核糖核蛋白体复合物，能剪切所有所有所有所有tRNAtRNA前体的前体的前体的前体的5‘5‘端，除去多余的序列，形成端，除去多余的序列，形成端，除去多余的序列，形成端，除去多余的序列，形成3’-OH3’-OH 和和和和 5’-5’-磷酸末端磷酸末端磷酸末端磷酸末端uuRNase PRNase P由由由由M1 RNAM1 RNA和和和和蛋白质亚基蛋白质亚基蛋白质亚基蛋白质亚基组成组成组成组成uu体外：体外：体外：体外： M1 RNAM1 RNA具催化作用，蛋白质作为辅助因子具催化作用，蛋白质作为辅助因子具催化作用，蛋白质作为辅助因子具催化作用，蛋白质作为辅助因子 uu体内：体内：体内：体内： M1 RNAM1 RNA和蛋白质对酶活性都是必需的和蛋白质对酶活性都是必需的和蛋白质对酶活性都是必需的和蛋白质对酶活性都是必需的uuRNase PRNase P可剪切前体可剪切前体可剪切前体可剪切前体5’5’端端端端41nt, 5’41nt, 5’端成熟端成熟端成熟端成熟uu不同不同不同不同tRNAtRNA的的的的 5’ 5’ 端没有顺序共同性，剪切的准确性与剪切端没有顺序共同性，剪切的准确性与剪切端没有顺序共同性，剪切的准确性与剪切端没有顺序共同性，剪切的准确性与剪切部位周围的核苷酸顺序无关，表明在部位周围的核苷酸顺序无关，表明在部位周围的核苷酸顺序无关，表明在部位周围的核苷酸顺序无关，表明在RNase PRNase P的组分内的组分内的组分内的组分内没有引导序列，没有引导序列，没有引导序列，没有引导序列， RNase PRNase P所识别的是底物的高级结构所识别的是底物的高级结构所识别的是底物的高级结构所识别的是底物的高级结构剪切位点剪切位点G结合位点结合位点保守序列保守序列剪接部位剪接部位引导序列引导序列G结合位点结合位点 I I类内含子二级结构通式类内含子二级结构通式类内含子二级结构通式类内含子二级结构通式 型内含子核酶型内含子核酶uu一类具有酶催化功能的内含子，转录成一类具有酶催化功能的内含子，转录成一类具有酶催化功能的内含子，转录成一类具有酶催化功能的内含子，转录成RNARNA后，可以自后，可以自后，可以自后，可以自剪接剪接剪接剪接uu其转录后可形成其转录后可形成其转录后可形成其转录后可形成9 9个碱基配对形成的特定二级结构，分别个碱基配对形成的特定二级结构，分别个碱基配对形成的特定二级结构，分别个碱基配对形成的特定二级结构，分别命名为命名为命名为命名为P1P1至至至至P9P9uu在剪接反应中，需要游离的鸟苷作辅助因子在剪接反应中，需要游离的鸟苷作辅助因子在剪接反应中，需要游离的鸟苷作辅助因子在剪接反应中，需要游离的鸟苷作辅助因子uu可以用来修复体内的有害突变基因可以用来修复体内的有害突变基因可以用来修复体内的有害突变基因可以用来修复体内的有害突变基因I型内含子催化其他型内含子催化其他RNA分子反应的几种类型分子反应的几种类型uu 转核苷酸作用转核苷酸作用转核苷酸作用转核苷酸作用 2CpCpCpC2CpCpCpCpCpC →→→→ CpCpCpCpC CpCpCpCpCpCpC + CpCpCpC + CpCpCpCuu 水解作用水解作用水解作用水解作用 CpCpCpCCpCpCpCpC pC →→→→ CpCpCpC + pC CpCpCpC + pCuu 转磷酸作用转磷酸作用转磷酸作用转磷酸作用 CpCpCpCpCpC CpCpCpCpCpCp p + UpCpU + UpCpU →→ CpCpCpCpCpC + UpCpU CpCpCpCpCpC + UpCpUp puu 去磷酸作用去磷酸作用去磷酸作用去磷酸作用 CpCpCpCpCCpCpCpCpCp p → → CpCpCpCpC + CpCpCpCpC +PiPiuu 限制性内切酶作用限制性内切酶作用限制性内切酶作用限制性内切酶作用 ̶ ̶CpUpCpUCpUpCpUpNpN̶̶ +G +G →→ CpUpCpU + CpUpCpU + GpNGpN̶̶II型内含子核酶型内含子核酶uu由由由由6 6个螺旋组成，分成个螺旋组成，分成个螺旋组成，分成个螺旋组成，分成3 3个部分：个部分：个部分：个部分：uu边界序列边界序列边界序列边界序列5’ GUGCG ···Yn5’ GUGCG ···YnA AGG，（，（，（，（Y Y代表嘧啶，代表嘧啶，代表嘧啶，代表嘧啶，n n代表任意核苷酸）代表任意核苷酸）代表任意核苷酸）代表任意核苷酸）uu3’3’茎环结构茎环结构茎环结构茎环结构uu分支点顺序分支点顺序分支点顺序分支点顺序 A A处于未配对状态，有一游离的处于未配对状态，有一游离的处于未配对状态，有一游离的处于未配对状态，有一游离的2’-OH2’-OHuu剪接机制：不需要鸟苷或鸟苷酸参加，但仍需要镁离子剪接机制：不需要鸟苷或鸟苷酸参加，但仍需要镁离子剪接机制：不需要鸟苷或鸟苷酸参加，但仍需要镁离子剪接机制：不需要鸟苷或鸟苷酸参加，但仍需要镁离子(Mg 2+)(Mg 2+)II型内含子核酶型内含子核酶uuIIII型内含子有一个型内含子有一个型内含子有一个型内含子有一个保守的二级结构保守的二级结构保守的二级结构保守的二级结构uu结构域结构域结构域结构域V V：高度保：高度保：高度保：高度保守，催化活性必需守，催化活性必需守，催化活性必需守，催化活性必需uu结构域结构域结构域结构域VIVI：未配对：未配对：未配对：未配对的的的的A A 提供提供提供提供2‘-OH2‘-OHII型内含子核酶型内含子核酶II型内含子核酶剪接机制型内含子核酶剪接机制脱氧核酶脱氧核酶uu指具有催化功能的指具有催化功能的指具有催化功能的指具有催化功能的 DNADNA分子称为脱氧核酶分子称为脱氧核酶分子称为脱氧核酶分子称为脱氧核酶 (DNAzyme)(DNAzyme)，又，又，又，又称酶性称酶性称酶性称酶性DNADNAuu在一定条件下可切割在一定条件下可切割在一定条件下可切割在一定条件下可切割RNARNA分子特定位点内部的磷酸二酯键分子特定位点内部的磷酸二酯键分子特定位点内部的磷酸二酯键分子特定位点内部的磷酸二酯键uu脱氧核酶的发现进一步延伸了酶的概念脱氧核酶的发现进一步延伸了酶的概念脱氧核酶的发现进一步延伸了酶的概念脱氧核酶的发现进一步延伸了酶的概念uu具有水解酶活性的脱氧核酶具有水解酶活性的脱氧核酶具有水解酶活性的脱氧核酶具有水解酶活性的脱氧核酶 以以以以RNARNA为底物的脱氧核酶：包括为底物的脱氧核酶：包括为底物的脱氧核酶：包括为底物的脱氧核酶：包括“ “10-23” DRz10-23” DRz和和和和“ “8-17” DRz8-17” DRz 以以以以DNADNA为底物的脱氧核酶：手枪型脱氧核酶为底物的脱氧核酶：手枪型脱氧核酶为底物的脱氧核酶：手枪型脱氧核酶为底物的脱氧核酶：手枪型脱氧核酶uu具有具有具有具有N-N-糖基化酶活性的脱氧核酶糖基化酶活性的脱氧核酶糖基化酶活性的脱氧核酶糖基化酶活性的脱氧核酶uu具有连接酶活性的脱氧核酶具有连接酶活性的脱氧核酶具有连接酶活性的脱氧核酶具有连接酶活性的脱氧核酶uu具有激酶活性的脱氧核酶具有激酶活性的脱氧核酶具有激酶活性的脱氧核酶具有激酶活性的脱氧核酶10-23型脱氧核酶作用机理型脱氧核酶作用机理手枪型脱氧核酶自我剪切作用机理手枪型脱氧核酶自我剪切作用机理核酶与核酶与RNA修复修复uu核酶是天然的具有催化能力的核酶是天然的具有催化能力的核酶是天然的具有催化能力的核酶是天然的具有催化能力的RNARNA分子，能特异性地催分子，能特异性地催分子，能特异性地催分子，能特异性地催化化化化RNARNA剪接剪接剪接剪接uu经过基因工程改造的核酶，可以位点特异性地切割任意经过基因工程改造的核酶，可以位点特异性地切割任意经过基因工程改造的核酶，可以位点特异性地切割任意经过基因工程改造的核酶，可以位点特异性地切割任意给定的给定的给定的给定的RNARNA分子分子分子分子uu剪接有两种形式：一是分子内不同部分间的剪接，称为剪接有两种形式：一是分子内不同部分间的剪接，称为剪接有两种形式：一是分子内不同部分间的剪接，称为剪接有两种形式：一是分子内不同部分间的剪接，称为顺式剪接；一是不同分子间的剪接，称为反式剪接顺式剪接；一是不同分子间的剪接，称为反式剪接顺式剪接；一是不同分子间的剪接，称为反式剪接顺式剪接；一是不同分子间的剪接，称为反式剪接uu反式剪接是修复反式剪接是修复反式剪接是修复反式剪接是修复RNARNA外显子突变的重要方法外显子突变的重要方法外显子突变的重要方法外显子突变的重要方法uu可以把正常基因或具有类似功能的基因相应片段，剪接可以把正常基因或具有类似功能的基因相应片段，剪接可以把正常基因或具有类似功能的基因相应片段，剪接可以把正常基因或具有类似功能的基因相应片段，剪接到异常到异常到异常到异常RNARNA上去，换下突变的部分上去，换下突变的部分上去，换下突变的部分上去，换下突变的部分修复修复RNA结构缺陷结构缺陷 uu利用核酶的剪接能力，可引入新的基因功能或修复已有的基因缺陷利用核酶的剪接能力，可引入新的基因功能或修复已有的基因缺陷利用核酶的剪接能力，可引入新的基因功能或修复已有的基因缺陷利用核酶的剪接能力，可引入新的基因功能或修复已有的基因缺陷uuN. LanN. Lan等对镰形细胞贫血突变的等对镰形细胞贫血突变的等对镰形细胞贫血突变的等对镰形细胞贫血突变的β β珠蛋白珠蛋白珠蛋白珠蛋白mRNAmRNA进行了修复进行了修复进行了修复进行了修复uu 镰刀形细胞贫血是由于镰刀形细胞贫血是由于镰刀形细胞贫血是由于镰刀形细胞贫血是由于β β珠蛋白基因第珠蛋白基因第珠蛋白基因第珠蛋白基因第6 6密码子中的一个密码子中的一个密码子中的一个密码子中的一个A A→→T T突变突变突变突变引起的引起的引起的引起的uu将来源于四膜虫组将来源于四膜虫组将来源于四膜虫组将来源于四膜虫组I I内含子的核酶改造，使之能专一性识别内含子的核酶改造，使之能专一性识别内含子的核酶改造，使之能专一性识别内含子的核酶改造，使之能专一性识别β β珠蛋白珠蛋白珠蛋白珠蛋白mRNAmRNA突变位点上游的特定序列突变位点上游的特定序列突变位点上游的特定序列突变位点上游的特定序列uu将将将将γ γ珠蛋白珠蛋白珠蛋白珠蛋白cDNAcDNA下游包括外显子在内的对应片段连接到这一核酶的下游包括外显子在内的对应片段连接到这一核酶的下游包括外显子在内的对应片段连接到这一核酶的下游包括外显子在内的对应片段连接到这一核酶的3’3’端端端端uu转染培养到病人外周血和脐带血干细胞后，均检测到转染培养到病人外周血和脐带血干细胞后，均检测到转染培养到病人外周血和脐带血干细胞后，均检测到转染培养到病人外周血和脐带血干细胞后，均检测到β β珠蛋白珠蛋白珠蛋白珠蛋白mRNAmRNA被剪接成被剪接成被剪接成被剪接成β β珠蛋白珠蛋白珠蛋白珠蛋白γ γ融合融合融合融合RNARNA分子，说明引入的功能基因得到表达分子，说明引入的功能基因得到表达分子，说明引入的功能基因得到表达分子，说明引入的功能基因得到表达uu胎儿型血红蛋白胎儿型血红蛋白胎儿型血红蛋白胎儿型血红蛋白( (HbFHbF，，，，α2α2γ γ2)2)与成人型血红蛋白与成人型血红蛋白与成人型血红蛋白与成人型血红蛋白( (HbAHbA，，，，α2β2α2β2) )功能相近，所以功能相近，所以功能相近，所以功能相近，所以γ γ珠蛋白的引入，可以代偿珠蛋白的引入，可以代偿珠蛋白的引入，可以代偿珠蛋白的引入，可以代偿βSβS珠蛋白珠蛋白珠蛋白珠蛋白所丧失的功能，起到治疗镰形细胞贫血的作用所丧失的功能，起到治疗镰形细胞贫血的作用所丧失的功能，起到治疗镰形细胞贫血的作用所丧失的功能，起到治疗镰形细胞贫血的作用Tγ γγ γβ ββ β恢复正常剪接途径恢复正常剪接途径uu基因突变有时会在内含子中生成新的剪接点，当然也是异常的剪接点。

基因突变有时会在内含子中生成新的剪接点，当然也是异常的剪接点基因突变有时会在内含子中生成新的剪接点，当然也是异常的剪接点基因突变有时会在内含子中生成新的剪接点，当然也是异常的剪接点它们与左邻右舍原来不起作用的隐匿的剪接点搭配起来，就会形成错它们与左邻右舍原来不起作用的隐匿的剪接点搭配起来，就会形成错它们与左邻右舍原来不起作用的隐匿的剪接点搭配起来，就会形成错它们与左邻右舍原来不起作用的隐匿的剪接点搭配起来，就会形成错误剪接误剪接误剪接误剪接uu由于原有的正常剪接点并未丧失功能，只是作用被异常剪接抑制，所由于原有的正常剪接点并未丧失功能，只是作用被异常剪接抑制，所由于原有的正常剪接点并未丧失功能，只是作用被异常剪接抑制，所由于原有的正常剪接点并未丧失功能，只是作用被异常剪接抑制，所以用反义核酸通过碱基互补，封闭异常剪接点或其他剪接元件，就可以用反义核酸通过碱基互补，封闭异常剪接点或其他剪接元件，就可以用反义核酸通过碱基互补，封闭异常剪接点或其他剪接元件，就可以用反义核酸通过碱基互补，封闭异常剪接点或其他剪接元件，就可堵住异常剪接途径，迫使剪接系统选择正确的途径，形成正常堵住异常剪接途径，迫使剪接系统选择正确的途径，形成正常堵住异常剪接途径，迫使剪接系统选择正确的途径，形成正常堵住异常剪接途径，迫使剪接系统选择正确的途径，形成正常RNARNA。

这就间接地对这就间接地对这就间接地对这就间接地对RNARNA缺陷作了缺陷作了缺陷作了缺陷作了“ “修复修复修复修复” ”uu剪接缺陷型突变往往使剪接缺陷型突变往往使剪接缺陷型突变往往使剪接缺陷型突变往往使mRNAmRNA失活，影响严重失活，影响严重失活，影响严重失活，影响严重 uuβ β地中海贫血是由于患者地中海贫血是由于患者地中海贫血是由于患者地中海贫血是由于患者β β珠蛋白基因突变，导致正常珠蛋白基因突变，导致正常珠蛋白基因突变，导致正常珠蛋白基因突变，导致正常β β链减少，红细胞链减少，红细胞链减少，红细胞链减少，红细胞内内内内α α和和和和β β链不平衡，缔合形成的成人型血红蛋白（链不平衡，缔合形成的成人型血红蛋白（链不平衡，缔合形成的成人型血红蛋白（链不平衡，缔合形成的成人型血红蛋白（α2β2α2β2）少了或者完全）少了或者完全）少了或者完全）少了或者完全没有引起的没有引起的没有引起的没有引起的 uu已发现的已发现的已发现的已发现的190190多种多种多种多种β β地中海贫血突变型中，有一部分属于剪接缺陷型地中海贫血突变型中，有一部分属于剪接缺陷型地中海贫血突变型中，有一部分属于剪接缺陷型地中海贫血突变型中，有一部分属于剪接缺陷型 C CC CC C—C CC CC C—C CC CC CC C反义反义反义反义RNARNAβ地中海贫血地中海贫血uu我国常见的内含子我国常见的内含子我国常见的内含子我国常见的内含子2 2第第第第654654位位位位C→T C→T 突变（突变（突变（突变（β654β654），就是在），就是在），就是在），就是在653653位形成位形成位形成位形成了一个新的剪接点，同时又激活了其上游了一个新的剪接点，同时又激活了其上游了一个新的剪接点，同时又激活了其上游了一个新的剪接点，同时又激活了其上游579579位一个潜在的剪接点，位一个潜在的剪接点，位一个潜在的剪接点，位一个潜在的剪接点，导致一段长度为导致一段长度为导致一段长度为导致一段长度为7373个碱基的内含子个碱基的内含子个碱基的内含子个碱基的内含子2 2序列插入到外显子序列插入到外显子序列插入到外显子序列插入到外显子2 2和和和和3 3之间，之间，之间，之间，形成异常形成异常形成异常形成异常mRNAmRNA，引起地中海贫血表型，引起地中海贫血表型，引起地中海贫血表型，引起地中海贫血表型uu由于突变基因原有的正常剪接点并未遭到破坏，仍然可以发挥作用，由于突变基因原有的正常剪接点并未遭到破坏，仍然可以发挥作用，由于突变基因原有的正常剪接点并未遭到破坏，仍然可以发挥作用，由于突变基因原有的正常剪接点并未遭到破坏，仍然可以发挥作用，所以用反义核酸封闭异常的所以用反义核酸封闭异常的所以用反义核酸封闭异常的所以用反义核酸封闭异常的653653或或或或579579位点，就能迫使人体剪接系统位点，就能迫使人体剪接系统位点，就能迫使人体剪接系统位点，就能迫使人体剪接系统回到正常剪接途径，减少异常回到正常剪接途径，减少异常回到正常剪接途径，减少异常回到正常剪接途径，减少异常mRNAmRNA的形成的形成的形成的形成uu反义封闭虽没有对反义封闭虽没有对反义封闭虽没有对反义封闭虽没有对β β珠蛋白基因的突变作任何修正，但是对突变珠蛋白基因的突变作任何修正，但是对突变珠蛋白基因的突变作任何修正，但是对突变珠蛋白基因的突变作任何修正，但是对突变RNARNA的错误剪接方式作了纠正，所产生的成熟的错误剪接方式作了纠正，所产生的成熟的错误剪接方式作了纠正，所产生的成熟的错误剪接方式作了纠正，所产生的成熟mRNAmRNA可以指导合可以指导合可以指导合可以指导合成正常珠蛋白链。

成正常珠蛋白链成正常珠蛋白链成正常珠蛋白链调整蛋白质肽链比例调整蛋白质肽链比例 uu突变基因的异常表达，往往扰乱体内蛋白质肽链之间的平衡，引起突变基因的异常表达，往往扰乱体内蛋白质肽链之间的平衡，引起突变基因的异常表达，往往扰乱体内蛋白质肽链之间的平衡，引起突变基因的异常表达，往往扰乱体内蛋白质肽链之间的平衡，引起疾病疾病疾病疾病uu反义封闭技术也可用来纠正基因表达的紊乱常见的血红蛋白反义封闭技术也可用来纠正基因表达的紊乱常见的血红蛋白反义封闭技术也可用来纠正基因表达的紊乱常见的血红蛋白反义封闭技术也可用来纠正基因表达的紊乱常见的血红蛋白HH病病病病（慢性溶血性贫血）的研究，就是一个比较理想的范例（慢性溶血性贫血）的研究，就是一个比较理想的范例（慢性溶血性贫血）的研究，就是一个比较理想的范例（慢性溶血性贫血）的研究，就是一个比较理想的范例uu正常人每个细胞有正常人每个细胞有正常人每个细胞有正常人每个细胞有4 4个个个个α α珠蛋白基因，珠蛋白基因，珠蛋白基因，珠蛋白基因，2 2个个个个β β珠蛋白基因，合成的珠蛋白基因，合成的珠蛋白基因，合成的珠蛋白基因，合成的α α和和和和β β链正好缔合成四聚体链正好缔合成四聚体链正好缔合成四聚体链正好缔合成四聚体α2β2α2β2血红蛋白血红蛋白H病病uu如果在如果在如果在如果在4 4个个个个α α珠蛋白基因中只有珠蛋白基因中只有珠蛋白基因中只有珠蛋白基因中只有1 1个正常，其余个正常，其余个正常，其余个正常，其余3 3个丢失或有缺陷，则红个丢失或有缺陷，则红个丢失或有缺陷，则红个丢失或有缺陷，则红细胞中细胞中细胞中细胞中α α链合成不足，链合成不足，链合成不足，链合成不足，β β链相对过剩。

多余的链相对过剩多余的链相对过剩多余的链相对过剩多余的β β链自行聚合为四聚体链自行聚合为四聚体链自行聚合为四聚体链自行聚合为四聚体β4β4，即血红蛋白，即血红蛋白，即血红蛋白，即血红蛋白HHuu血红蛋白血红蛋白血红蛋白血红蛋白HH不稳定，容易解体生成游离的不稳定，容易解体生成游离的不稳定，容易解体生成游离的不稳定，容易解体生成游离的β β链，游离链在红细胞内沉淀链，游离链在红细胞内沉淀链，游离链在红细胞内沉淀链，游离链在红细胞内沉淀形成形成形成形成HH包涵体，附着在红细胞膜上，使膜受损失去柔韧性这种红细包涵体，附着在红细胞膜上，使膜受损失去柔韧性这种红细包涵体，附着在红细胞膜上，使膜受损失去柔韧性这种红细包涵体，附着在红细胞膜上，使膜受损失去柔韧性这种红细胞易被脾脏破坏，导致血红蛋白胞易被脾脏破坏，导致血红蛋白胞易被脾脏破坏，导致血红蛋白胞易被脾脏破坏，导致血红蛋白HH病病病病uu血红蛋白血红蛋白血红蛋白血红蛋白HH病的基本病因是病的基本病因是病的基本病因是病的基本病因是α α链偏少，链偏少，链偏少，链偏少，β β链偏多，可以采用反义封闭表链偏多，可以采用反义封闭表链偏多，可以采用反义封闭表链偏多，可以采用反义封闭表达偏多的正常达偏多的正常达偏多的正常达偏多的正常β mRNAβ mRNA，使，使，使，使β β链合成减少，与本身不足的链合成减少，与本身不足的链合成减少，与本身不足的链合成减少，与本身不足的α α链在低水平链在低水平链在低水平链在低水平上达成平衡，从而改善临床症状上达成平衡，从而改善临床症状上达成平衡，从而改善临床症状上达成平衡，从而改善临床症状uu这一策略反其道而行之，不是修正，而是抑制基因功能，属于一种广这一策略反其道而行之，不是修正，而是抑制基因功能，属于一种广这一策略反其道而行之，不是修正，而是抑制基因功能，属于一种广这一策略反其道而行之，不是修正，而是抑制基因功能，属于一种广义的义的义的义的RNARNA功能修复功能修复功能修复功能修复Ribozyme的应用前景的应用前景uu抗抗抗抗AIDSAIDSuu抗白血病抗白血病抗白血病抗白血病uu抗病毒病抗病毒病抗病毒病抗病毒病uu抗肿瘤抗肿瘤抗肿瘤抗肿瘤uu抗抗药性抗抗药性抗抗药性抗抗药性抗抗AIDSuuHangHang等证实锤头状等证实锤头状等证实锤头状等证实锤头状ribozymeribozyme在体外系统中可在不同位点有效地剪在体外系统中可在不同位点有效地剪在体外系统中可在不同位点有效地剪在体外系统中可在不同位点有效地剪切切切切HIV-1HIV-1病毒病毒病毒病毒RNARNA的的的的gaggag基因基因基因基因uuSaverSaver等则证实等则证实等则证实等则证实ribozymeribozyme可在细胞剪切可在细胞剪切可在细胞剪切可在细胞剪切HIV-1HIV-1病毒病毒病毒病毒RNARNAuu他们构建了一个质粒，该质粒含抗他们构建了一个质粒，该质粒含抗他们构建了一个质粒，该质粒含抗他们构建了一个质粒，该质粒含抗HIV-1HIV-1病毒病毒病毒病毒gaggag基因的基因的基因的基因的ribozymeribozyme基因，该基因由人基因，该基因由人基因，该基因由人基因，该基因由人ß-actinß-actin启动子操纵启动子操纵启动子操纵启动子操纵uu它被脂质体包裹后转染它被脂质体包裹后转染它被脂质体包裹后转染它被脂质体包裹后转染Hela CD4+Hela CD4+细胞，当用细胞，当用细胞，当用细胞，当用HIV-1HIV-1感染稳定表达感染稳定表达感染稳定表达感染稳定表达ribozymeribozyme的的的的 CD4+ HelaCD4+ Hela细胞后，病毒细胞后，病毒细胞后，病毒细胞后，病毒RNARNA水平和标记抗原水平和标记抗原水平和标记抗原水平和标记抗原P24P24的的的的水平比对照细胞有明显降低水平比对照细胞有明显降低水平比对照细胞有明显降低水平比对照细胞有明显降低uu19981998年，美国加利福尼亚大学年，美国加利福尼亚大学年，美国加利福尼亚大学年，美国加利福尼亚大学Wong-StaalWong-Staal等利用发夹核酶抑制等利用发夹核酶抑制等利用发夹核酶抑制等利用发夹核酶抑制HIV-ⅠHIV-Ⅰ基因表达，并在基因表达，并在基因表达，并在基因表达，并在Ⅰ Ⅰ期临床实验中受到良好效果期临床实验中受到良好效果期临床实验中受到良好效果期临床实验中受到良好效果抗白血病抗白血病uu慢性粒细胞性白血病慢性粒细胞性白血病慢性粒细胞性白血病慢性粒细胞性白血病(CML)(CML)病人体内，有基因重排现象病人体内，有基因重排现象病人体内，有基因重排现象病人体内，有基因重排现象uu一个融合基因，一个融合基因，一个融合基因，一个融合基因，BCRBCR／／／／ABLABL．是发病原因．是发病原因．是发病原因．是发病原因uu该基因编码该基因编码该基因编码该基因编码2 2种种种种mRNAmRNA、、、、B3A2B3A2和和和和B2A2B2A2，二者都可翻译出，二者都可翻译出，二者都可翻译出，二者都可翻译出210ku210ku的酪氨的酪氨的酪氨的酪氨酸激酶酸激酶酸激酶酸激酶uu针对此针对此针对此针对此RNARNA的一些短的合成的的一些短的合成的的一些短的合成的的一些短的合成的ribozymeribozymeuu用用用用DOTAPDOTAP阳离子脂质体导入阳离子脂质体导入阳离子脂质体导入阳离子脂质体导入CML K562CML K562细胞株细胞株细胞株细胞株uu72h72h后，蛋白质的表达降到后，蛋白质的表达降到后，蛋白质的表达降到后，蛋白质的表达降到23%23%uu 在另一实验中，一合成的在另一实验中，一合成的在另一实验中，一合成的在另一实验中，一合成的DNA-RNADNA-RNA杂合杂合杂合杂合ribozymeribozyme，可完全抑制酪氨，可完全抑制酪氨，可完全抑制酪氨，可完全抑制酪氨酸激酶的表达酸激酶的表达酸激酶的表达酸激酶的表达抗病毒病抗病毒病uuZheng Zheng 等在培养的组织细胞中，设计针对淋巴细胞绒毛膜脑膜炎病毒等在培养的组织细胞中，设计针对淋巴细胞绒毛膜脑膜炎病毒等在培养的组织细胞中，设计针对淋巴细胞绒毛膜脑膜炎病毒等在培养的组织细胞中，设计针对淋巴细胞绒毛膜脑膜炎病毒的的的的ribozyme ribozyme ，能降低病毒的，能降低病毒的，能降低病毒的，能降低病毒的RNARNA量，使病毒感染减轻量，使病毒感染减轻量，使病毒感染减轻量，使病毒感染减轻uuTangTang等设计了阻断流感病毒等设计了阻断流感病毒等设计了阻断流感病毒等设计了阻断流感病毒A A的锤头状和发夹型的锤头状和发夹型的锤头状和发夹型的锤头状和发夹型ribozymeribozymeuu目前人们已进行了核酶抗甲型肝炎病毒（目前人们已进行了核酶抗甲型肝炎病毒（目前人们已进行了核酶抗甲型肝炎病毒（目前人们已进行了核酶抗甲型肝炎病毒（HAV)HAV)、乙型肝炎病毒（、乙型肝炎病毒（、乙型肝炎病毒（、乙型肝炎病毒（ HBVHBV）、丙型肝炎病毒（）、丙型肝炎病毒（）、丙型肝炎病毒（）、丙型肝炎病毒（ HCV HCV）以及）以及）以及）以及HDVHDV作用的研究作用的研究作用的研究作用的研究uu人工设计核酶多为锤头状结构，少部分是采用发夹状核酶人工设计核酶多为锤头状结构，少部分是采用发夹状核酶人工设计核酶多为锤头状结构，少部分是采用发夹状核酶人工设计核酶多为锤头状结构，少部分是采用发夹状核酶 抗肿瘤抗肿瘤uuKashaniKashani证明证明证明证明ribozymeribozyme可改变组织培养基上的人膀胱肿瘤细胞的形可改变组织培养基上的人膀胱肿瘤细胞的形可改变组织培养基上的人膀胱肿瘤细胞的形可改变组织培养基上的人膀胱肿瘤细胞的形态和生长行为态和生长行为态和生长行为态和生长行为uu当裸鼠移植植了表达该种当裸鼠移植植了表达该种当裸鼠移植植了表达该种当裸鼠移植植了表达该种ribozymeribozyme的肿瘤细胞后，其存活率比对照的肿瘤细胞后，其存活率比对照的肿瘤细胞后，其存活率比对照的肿瘤细胞后，其存活率比对照提高了提高了提高了提高了2 2倍倍倍倍uu核酶能在特定位点准确有效地识别和切割肿瘤细胞的核酶能在特定位点准确有效地识别和切割肿瘤细胞的核酶能在特定位点准确有效地识别和切割肿瘤细胞的核酶能在特定位点准确有效地识别和切割肿瘤细胞的mRNAmRNA，抑制，抑制，抑制，抑制肿瘤基因的表达，达到治疗肿瘤的目的肿瘤基因的表达，达到治疗肿瘤的目的肿瘤基因的表达，达到治疗肿瘤的目的肿瘤基因的表达，达到治疗肿瘤的目的抗抗药性抗抗药性uu多药耐药性是影响肿瘤化疗疗效的一大难点，它使病人对结构和多药耐药性是影响肿瘤化疗疗效的一大难点，它使病人对结构和多药耐药性是影响肿瘤化疗疗效的一大难点，它使病人对结构和多药耐药性是影响肿瘤化疗疗效的一大难点，它使病人对结构和功能不同的化疗药物不再敏感，这与抗药基因功能不同的化疗药物不再敏感，这与抗药基因功能不同的化疗药物不再敏感，这与抗药基因功能不同的化疗药物不再敏感，这与抗药基因(MDR)(MDR)以及以及以及以及fosfos基因基因基因基因产物等有关产物等有关产物等有关产物等有关uuScanlonScanlon等研究等研究等研究等研究fosfos基因产物在抗原性方面的作用，他们发现，活性基因产物在抗原性方面的作用，他们发现，活性基因产物在抗原性方面的作用，他们发现，活性基因产物在抗原性方面的作用，他们发现，活性ribozymeribozyme抑制抑制抑制抑制c-fosc-fos的表达比失活的的表达比失活的的表达比失活的的表达比失活的ribozymeribozyme要强要强要强要强7 7倍倍倍倍核酶技术面临的问题核酶技术面临的问题uu核酶催化切割反应的可核酶催化切割反应的可核酶催化切割反应的可核酶催化切割反应的可 逆性问题逆性问题逆性问题逆性问题uu催化效率低，提高催化效率催化效率低，提高催化效率催化效率低，提高催化效率催化效率低，提高催化效率uu寻找合适载体将核酶高效、特异地导入靶细胞寻找合适载体将核酶高效、特异地导入靶细胞寻找合适载体将核酶高效、特异地导入靶细胞寻找合适载体将核酶高效、特异地导入靶细胞uu使核酶在细胞内有调控地高效表达使核酶在细胞内有调控地高效表达使核酶在细胞内有调控地高效表达使核酶在细胞内有调控地高效表达uu增强核酶在细胞内的稳定性增强核酶在细胞内的稳定性增强核酶在细胞内的稳定性增强核酶在细胞内的稳定性uu对宿主的损伤问题有待进一步考察对宿主的损伤问题有待进一步考察对宿主的损伤问题有待进一步考察对宿主的损伤问题有待进一步考察新技术新技术 新思路新思路uu设计出具核酶活性的反义设计出具核酶活性的反义设计出具核酶活性的反义设计出具核酶活性的反义RNARNA，既能与，既能与，既能与，既能与mRNAmRNA互补结合互补结合互补结合互补结合阻止阻止阻止阻止mRNAmRNA的翻译，又带有锤头状结构基因，能对靶序的翻译，又带有锤头状结构基因，能对靶序的翻译，又带有锤头状结构基因，能对靶序的翻译，又带有锤头状结构基因，能对靶序列（列（列（列（mRNAmRNA）特异性切割，可反复使用）特异性切割，可反复使用）特异性切割，可反复使用）特异性切割，可反复使用。