食品中大小分子互作用.ppt

食品中大分子与小分子的相互作用,,引言,光谱学技术探究食品中的大小分子互作,热力学技术探究食品中的大小分子互作,分子模拟及其他相关技术,CONTENT,结语,01,引言,PART ONE,生物大分子主要为蛋白质、多糖、核酸等 在与小分子相互作用研究中涉及的小分子种类繁多，主要有内源物质、中性分子、离子、食品营养成分及添加剂、表面活性剂、药物(包括抗癌药物、抗菌素药物、心血管类药物、杀虫剂、生物毒剂等)及制剂辅料、蛋白质的变性剂以及蛋白质、DNA测试探针试剂等大分子与小分子,相互作用类型,蛋白质：小分子与蛋白质间多是非共价键的作用, 包括静电作用、氢键、范德华力等,虽然非共价相互作用很弱(一般小于10kJ/mol,比通常的共价键键能小1 ～ 2个数量级),作用范围为0.3 ～ 0.5nm, 但这些分子间弱相互作用力可在一定条件下起加合与协同作用,形成有一定方向性和选择性的强作用力,而这种强作用力是分子识别与组装的基础 核酸： DNA与靶向分子之间的相互作用主要有非共价键作用、共价键作用和剪切作用三种非共价键相互作用的方式主要有： 1，外部静电结合(Electrostatic Binding) 2，沟区(大沟区、小沟区)结合(Groove Binding) 3，嵌插结合(Imercalative Binding) 多糖：多糖类大分子可以通过静电力和疏水效应等弱相互作用力与小分子如表面活性剂发生相互作用,从而使混合体系的性能不同于单一体系者。

研究思路,形成复合物,,,,性质改变,分析方法,获得信息,大分子与小分子物质作用后生成超分子复合物,体系中大分子或者小分子物质的浓度、光谱、电化学等性质发生改变,通过适当的分析方法，测定作用前后不同参数的变化值,可以获得作用机理、结合常数、结合位置、结合位点数、作用力类型以及小分子对蛋白质二级结构的影响等信息,研究意义,深入了解复合物效应 小分子与靶部位的生物大分子作用后，将使后者发生变化，由于这种变化而引起一系列生物体内的物理变化或化学变化，最终体现为效应可以简单地理解为外源性小分子与生物大分子相互作用的整体应答理解作用机理与过程 小分子与生物大分子间非共价键的作用, 对其本质的研究, 有助于理解在食品科学、生命科学、医学、药学领域中涉及到的分子之间的相互作用以及相互识别过程 实际应用 食品中大分子与小分子的相互作用，使其理化性质发生一定的改变，利用其可进行蛋白质、多糖的改性、核酸的修饰，以满足在食品研究领域中的分析鉴定需要乃至生产加工需求02,光谱学技术探究食品中的 大小分子互作用,PART TWO,前表面荧光技术 前表面荧光方法是将入射光与样品成30°或56°，只对比色杯表面一层的待测物质进行检测，样品的光照面较大，可减少样品位置的敏感性，适用于不透明的样品，省去了很多对样品前处理的步骤，适用于快速检测。

同步荧光光谱技术 同步荧光技术是在同时变化激发和发射波长的情况下进行扫描，由测得的荧光强度信号对发射或激发波长作图，即为同步荧光光谱三维荧光光谱技术 三维荧光光谱能较完整地表达研究体系的荧光信息，三维荧光等高线图具有指纹性，利用这些光谱信息结合化学计量学技术可完成多组分混合物体系中较为复杂的定量与定性分析任务 但是，获取三维荧光光谱的时间较长分子荧光光谱法,食品中大分子与小分子的相互作用,岩藻黄素,乳清蛋白,荧光光谱扫描,吸收光谱扫描,红外光谱扫描,岩藻黄素对乳清蛋白内源荧光的影响,进一步确定岩藻黄素对乳清蛋白的淬灭机制,确定乳清蛋白在岩藻黄素添加前后的二级结构变化,例：探究岩藻黄素与乳清蛋白的相互作用,Food Hydrocolloids, 2017, 63:391-403.,结果,表明，岩藻黄素能够减少乳清蛋白荧光团的量子产率，引起乳清蛋白内源荧光的淬灭通过扫描淬灭前后乳清蛋白紫外吸收光谱的变化，确认蛋白质–配体复合物的形成通常，动态淬灭仅影响荧光分子的激发态，对吸收光谱不会产生影响，而静态淬灭会导致荧光分子吸收光谱的变化 吸收光谱的差异证实了岩藻黄素对乳清蛋白的淬灭过程遵循静态淬灭机制。

结果,使用同步荧光、三维荧光和FT-IR对乳清蛋白结合岩藻黄素后的构象变化做进一步研究同步荧光可以提供关于发色团附近的环境信息随着岩藻黄素添加到BSA中，可观察到Δλ = 15 nm同步荧光峰轻微红移，说明岩藻黄素可以扰乱BSA中Tyr残基的微环境，发生从非极性到微极性的转变三维荧光技术可以全面展示生物大分子的内源荧光信息，使构象研究更加科学可信 峰2（λex = 230 nm）主要代表了C=O多肽链骨架结构的荧光行为这个峰的减少表明纳米复合物的形成导致乳清蛋白骨架松弛，发生解折叠，进一步表明岩藻黄素与乳清蛋白多肽链中氨基酸残基存在相互作用红外光谱,为了进一步验证结合岩藻黄素后乳清蛋白发生的解折叠，通过红外自解卷积分析了BSA结合岩藻黄素前后 二级结构的变化圆二色谱 (circular dichroism, CD),圆二色谱法(circular dichroism, CD) 是通 过测定不对称分子对 左、右圆偏振光吸收 的不同来进行结构分 析，其在远紫外区（180-250nm)，和近紫外区（250nm~可见光）的谱图提供了蛋白质二级结构和三级结构的信息目前被广泛应用于大分子的结构与功能的研究以及配基 (小分子或大分子药物)与它们的相互作用研究中。

圆二色谱 (circular dichroism, CD),CD signal of a protein depends on its second structure,圆二色谱 (circular dichroism, CD),近紫外CD谱可作为一种灵敏的光谱探针，反映Trp、Tyr和Phe及二硫键所处微环境的扰动，能用来研究蛋白质三级结构精细变化 VIP: 近紫外CD光谱测量所需蛋白质溶液的浓度一般比远紫外CD测量高1～2个数量级.,蛋白芳香族氨基酸残基微环境,蛋白质中芳香氨基酸残基，如色氨酸(Trp)、酪氨酸(Tyr)、苯丙氨酸(Phe)及二硫键处于不对称微环境时，在近紫外区250～320 nm， 表现出CD信号溶剂的选择一定要尽 可能的避免溶剂在考 察的波长范围内有吸 收值！,微量热泳动仪---MST,微量热泳动仪是近年来刚兴起的一项技术2010年底的一篇Nature的文章最先报道了NanoTemper公司创始人Dr. Stefan和 Dr. Philipp使用MST测量生物溶液中蛋白-蛋白之间的相互作用，引起了很多科研人员的极大兴趣Nature communications 1 (2010): 100.,这项技术基于生物分子的热泳动，微量热泳动仪使用红外激光进行局部加热导致分子定向移动，导致发生相互作用的生物分子的水化层、分子大小、电荷等分子性质发生改变，进而引起反应体系中荧光分布的变化，以检测相互作用的生物分子间的亲和性。

特点：MST将荧光检测的精准性与热泳动的灵活性及灵敏度结合起来，快速、可信地检测分子间相互作用相互作用的过程可以在天然条件下，无需固定、任何生物溶液中完成测量也可以认为是一种光谱学技术）,MST是一种分析生物分子相互作用的新技术,03,PART THREE,热力学技术探究食品中的大小分子相互作用,等温滴定量热仪( ITC),ITC是一种检测由结合成分添加而起始的任何化学反应的热力学技术，即一种反应物滴加另一种反应物，测定反应体系温度的变化 准确、原位、无损伤地同时提供热力学和动力学信息 在一次试验中，ITC可以测定大分子与小分子之间： 结合的亲和力常数（K） 结合反应中的焓变和熵变（ΔH，ΔS） 相互作用化学计量结合位点数,,,,独特特点,1. 对被研究体系的溶剂性质、光谱性质和电学性质等没有任何限制条件，即具有非特异性的独特优势 2. 样品用量较少，方法的灵敏度和精确度高（最小检测热效应0.125uJ，最小用量0.4ug，温度范围2-80℃） 3. 实验时间较短（典型时间30-60min）；对样品无破坏,应用范围,1. 量化结合亲和力 2. 候选药物的选择与优化 3 测定热力学特性和活性浓度 4. 作用机制表征 5. 在小分子药物发现过程中确认预期结合靶标 6. 测定结合特异性和化学计量 7. 验证从苗头化合物到先导化合物演化过程中的IC50值和EC50值 8. 酶动力学测定,食品中应用实例：酪蛋白与单宁酸的相互作用,Food Hydrocolloids, 75(2018), 81-87.,如图是典型的ITC数据图。

配体溶液单宁酸通过20次注射到ITC池中的酪蛋白溶液中，我们可以看到每个注射峰（上图）所显示的数值即为体系所进出的热量，负值可以证明整个反应是放热的.同时，如此明显的焓变也说明蛋白质与单宁酸之间发生了某种相互作用此外，通过机器分析我们可以得到以下基本信息： N值代表结合位点数：说明平均0.968个单宁酸分子与一个酪蛋白分子相结合 K值代表结合常数表明的二者之间结合能力的大小为6.32 * 10-4M ΔH代表反应涉及的焓变 -6.167cal/mol ΔS代表反应涉及的熵变-19.5 cal/mol/deg 同时均为负值的焓变与熵变说明二者直接的结合通过弱相互作用进行，并主要对应于范德华力和氢键,04,分子模拟其他相关技术,,1. 分子模拟,分子模拟是指通过现代计算机强大的数据处理和图形显示功能，在计算机上对分子体系及其相互作用进行计算、模拟、分析，从而解释已有实验现象，或为新的研究提供指导和预测 其理论基础是量子力学 （Quantum Mechanis,QM） 分子力学（Molecular Mech -anics,MM）以及量子力学 /分子力学杂合方法（QM/ MM）,,1.1岩藻黄素与乳清蛋白自组装的分子模拟,Docking,MD,London N, Miller R M, Krishnan S, et al. Nature Chemical Biology, 2014. Dror R O, Green H F, Valant C, et al. Nature, 2013.,,氢键,,氢键,分子对接——对接构象与能量,Food Hydrocolloids ,63 (2017) , 391-403,分子动力学模拟—回转半径、二级结构,蛋白质回转半径 Rg,蛋白质二级结构组成变化,回转半径代表蛋白紧密程度，结合岩藻黄素后，乳清蛋白回转半径减小，表明结构变得松散。

主要二级结构比例减少，表明乳清蛋白发生了部分解折叠Food Hydrocolloids ,63 (2017) , 391-403,1. 原子力显微镜（AFM）,牛血清蛋白和金丝桃苷相互作用前后：蛋白质发生聚集，粒径增大,Food Hydrocolloids, 75(2010), 21-31.,2. 电位粒度仪--ZS90：微电泳技术及动态光扫描技术 测量大分子结合小分子前后的水合半径、分子表面ζ-电势的变化,3. 核磁共振波谱技术（NMR）,核磁在解析大分子三维结构上有独特的优势，因此近年来在小分子与大分子相互作用方面也有应用，但是由于核磁对样品要求就高，这种方法也具有一定的局限性,05,结语,随着实验技术，仪器设备的不断发展，整体实验水平不断提高，生物大分子-小分子的相互作用的研究会愈来愈透彻，但用于研究中的大分子样品与其所处的生理环境实际上时有所差别的，因此任何一个单一方法都有一定的局限性把光谱学方法，热力学方法，分子模拟等等相结合起来综合运用，从多方面多角度对一个反应体系进行研究，不仅能从宏观角度，还能够通过微观角度全面得进行分析，而且不同方法得到的结果相互印证，所得到的结果就更加精准更具说服力,结语,。