八种常用生化实验步骤.docx

实验一基因的PCR扩增技术一、实验目的与原理简介聚合酶链式反应（polymerase chain reaction）是体外克隆基因的重要方法，它可在 几个小时内使模板分子扩增百万倍以上因此能用于从微量样品中获得目的基因，同时完成 了基因在体外的克隆，是分子生物学及基因工程中极为有用的研究手段常规PCR反用于已知DNA序列的扩增，具体可分为三个主要过程：一、变性通过升高 温度使DNA双链模板分子中氢断裂，形成单链DNA分子，温度为94°C，时间lmin二、复 性降低温度使DNA单链分子同引物结合温度为55C，时间lmin三、延深升高温度, 在DNA聚合酶最佳活性的条件下在引物3端加入dNTP，实现模板的扩增，温度为72C，时 间2min同时第一步变性前要在94C下预变性5分钟，使DNA双链完全解开经过25-35 个循环之后，在72C下继续延伸10分钟PCR反应包含的七种基本成分：1） 热稳定性DNA聚合酶：Taq DNA聚合酶是最常适用的酶，商品化Taq DNA酶的特异性 活性约为80000单位/mg.2） 寡核苷酸引物：寡核苷酸引物的设计是影响PCR扩增反应的效率与特异性的关键因 素3） 脱氧核苷三磷酸（dNTP）：标准的PCR反应体系应包括4种等摩尔浓度的脱氧核苷三 磷酸，即dATP、dTTP、dCTP和dGTP。

每种dNTP的浓度一般在200-250卩l之间，高 浓度的dNTP对扩增反应会起抑制作用，可能是dNTP与Mg2+螯合有关4） 二价阳离子：一般需要Mg2+来激活热稳定的DNA聚合酶，由于dNTP与寡聚核酸结Mg2+ 合，因而反应体系中阳离子的浓度一般要超过dNTP和引物来源的磷酸盐基团的摩尔 浓度Mg2+的最佳浓度为1.5mmol/L5） 维持PH值的缓冲液：用Tris-Cl在室温将PCR缓冲液的PH值调至8. 3-8.8之间， 标准PCR缓冲液浓度在10mmol/L在72C温育时，反应体系的温度将下降1个多单 位，致使缓冲液的PH值接近7.26） 一价阳离子：标准PCR缓冲液内含有50mmol/L的KCl,它对扩增大于500bp长度的 DNA是有益的7） 模板DNA：含有靶序列的模板DNA可以以单链或双链形式加入到PCR混合液中，闭环 DNA的及增效率略低于线性DNA学习PCR反应的基本原理和基本技术了解引物设计的一般要求二、材料和试剂10X扩增缓冲液4 种 dNTP 贮存液（20mmol/L，PH &0）Tap DNA聚合酶5 端引物（20umol/L）及 3 端引物（20umol/L）模板DNA琼脂糖凝胶PCR仪（Bio-Rad公司） 移液枪（0.5-10uL 5-50uL）枪头 微量移液管一、 实验操作1） 按照以下次序，将各成分加到微量离子管内混合：1 0 X扩增缓冲液 2 . 5 u lM g 2 + 1 . 5 u l5 端 引 物1l1 6 .25l25l0.25l1P13 端 引 物DDWdNTPT aq 酶模板2) 按照以下方法进行PCR扩增:循环数预变性变性复性后延伸由循环数—35个循环——预变性 95 °C 5min——变性——94C 1min 复性 63C 1min 刃巳1-1 72C 1min——后延伸 72C—Wmifi 聚合反应时间是根据靶基因的长度按每分钟聚合lOOObp的速率来计算出来的。

3) 抽取每种扩增样品5-10P1,用琼脂糖电泳来分析扩增结果，用DNA marker来判断扩增片段的大小凝胶一般用Goldview染色后观察扩增的量与片段大小从阳性对照样品的相对分子量的目的条带的亮度与粗细可以判断PCR扩增的效率；阴性对照样品在目的条带附近应该没 有相应条带二、对可能发生PCR过程中主要疑难问题的解析 表^_多种PCR扩增过程 的一些疑难问题的诊断与解决方法 现象 可能原因 补救措施 扩增的目的条带试剂不合格；PCR仪有故障；在两台不同的PCR仪上用新鲜购买的试剂与老的试剂分别进行较弱或不能检测扩增程序有错误；PCR,比较扩增产物结果到相应的条带复性条件不是最合适的重新计算引物Tm，必要时优化引物浓度若是引物问题，要重新合成引物被复性结合到模板上的优化MgCl『模板DNA、和dNTP的浓度；引物不适合延伸重新纯化模板DNA以除去抑制物；在恒定复性温度下增加PCR循环数变性不完全增加变性时间或设置更调质变性温度两个引物之间的距离太大多种扩增产物条带引物二聚体过量应用那些能够扩增大的DNA片段的热稳定的DNA聚合酶 优化MgCl『模板DNA、热稳定性DNA聚合酶和dNTP的浓度。

用首次扩增的PCR产物进行1： 100稀释后作为模板，再加入 新的PCR缓冲液与引物在恒定复性温度条件下进行30个循环 的第二次PCR扩增；或者进行嵌套式PCR扩增；或者从凝胶上 割取取目的条带作模板重新进行PCR扩增应用降落PCR；重新设计合成引物，特别注意引物3末端的序实验二、碱裂解法大量提取质粒DNA及检测三、 实验目的与原理简介质粒DNA的提取是基因工程操作中常用的基本技术质粒作为载体应具备下列四个特点：①有足够的容纳目的基因的幅度， 并且对于携带的目的基因能够借助载体的复制和调控系统得到忠实的复制与增殖②在非必要的DNA克隆区有多种限制性核酸 内切酶的单一识别位点，易于基因片段与载体的连接、重组与筛选③与宿主细胞有天与一个或多个遗传表型（如抗药性、营 养缺陷型或显色表型反应等）④拷贝数多，易于宿主细胞的DNA分开，便于分离提纯分离质粒DNA的方法包括三个基本步骤：培养细胞使质粒扩增；收集和裂解细菌；分离和纯化质粒DNA碱裂解法质粒DNA是基于染色体DNA与质粒DNA的变性与复性的差异而达到分离目的的在强碱性pH时，染色体线性DNA 的氢键断裂，双螺旋结构解开而变性质粒DNA的大部分氢键也断裂，但超螺旋共价闭合环状的两条互补链不会完全分离，调 节pH值至中性时，变性的质粒DNA又恢复到原来的构型，而染色体DNA不能复性纠缠形成网状结构，经过离心，染色体DNA与 不稳定的大分子RNA、蛋白质-SDS复合物等一直沉淀下来而被除去。

提取基因工程中运载基因的载体，掌握最常用的提取质粒DNA的方法二．试剂及步骤试剂配制：Sol I： 1M Tris-HCL （pH8.0） 2.5ml, 0.5M EDTA 2ml, DDW 91ml, 20% 葡萄 糖4.5ml（葡萄糖单独灭，灭完后加进Sol I）,高压灭菌，4°保存SolH：（新鲜配制， 常温使用）10% SDS 50ml， 2M NaOH 50ml或者每 100ml： SDS 1g，NaOH 0.8g,加 DDW 定 容至100ml不要剧烈搅拌！Sollll： KAc 147g, HAc57.5ml,加 300mlDDW搅拌，定容至 500ml高压灭菌，4° 保存 STE buffer： 1MTris-HCl（pH8.0）1ml， 0.5MEDTA0.2ml,Nacl0.5844g,DDW98.8ml 高压灭菌！ 70%乙醇 10ml 5M LiCl 20ml3M醋酸钠，pH5.2酚/氯仿/异戊醇无菌水DDW13%（W/V）PEG8000, 1.6M NaCl:6.5g PEG,4.6752g NaCl,加水定容至 50ml,过滤除菌.（仅由 第一组配制）按1/100的比例接种保存的pPIC9K大肠杆菌克隆菌种到3 mL的含有适当抗生素LB培 养基，37°C、180rpm培养过夜或培养12小时以上，活化菌种（至对数生长期）。

将活化的菌 种按1/100接种至200 ml的LB培养基，37C、250rpm剧烈震荡培养过夜1•离心管（50mL）分装菌液，离心去上清（10000rpm, 5min, 4C）；重悬于15mL （原始菌液的1/4体积）STE中，离心去上清（10000rpm, 1-2min, 4C）离心结束尽可能吸干上 清液2•重悬于2mL冰冷的Sol I中；剧烈震荡重悬菌体3. 加入4mL Solll轻轻颠倒数次（动作要轻柔，防止断裂DNA形成碎片），彻底混匀，室温 放置10min4. 加入3mL冰冷的Sollll立即轻轻颠倒完全彻底混匀，冰上放置10min5.4°C, lOOOOrpm 离心 1 Omin6. 脱脂棉过滤收集上清至新的离心管，加等体积异丙醇，混匀沉淀核酸，室温放置大于10min7. 室温，lOOOOrpm离心15min,小心弃去上清，收集核算沉淀；将离心管倒置纸巾上以除去 残余的上清8. 少许7O%乙醇清洗管壁及沉淀，室温挥发（一般室温放置1O-15min足够）；9. 加3mL预冷DDW溶解核算沉淀10•加等体积预冷5M LiCl，混匀，于4°C ， 1OOOOrpm离心1Omin,取上清至新的离心管。

沉淀大分子RNA及蛋白）11•加等体积异丙醇，混匀沉淀核算，离心去上清（12OOOrpm,15min,室温）12•小心倒去上清，倒置管口，使液体溜干少许7O%乙醇清洗管壁及沉淀，室温挥发13.用49OAL DDW溶解核酸沉淀，将溶液转移至1.5 mL离心管中，加入RNaes A至终浓度2O^g/mL, 37C反应 45min14加 5OOAL [13%（W/V）PEG8OOO, 1.6M NaCl]，混匀静置，4C沉淀 3-4h15•最大转速（12OOOrpm）离心2Omin,回收DNA沉淀；沉淀用5OOAL7O%乙醇重悬以除去微 量PEG,高速离心5min以回收核酸；吸取乙醇，重复一次，室温挥发乙醇16.5OOALDDW溶解DNA，用等体积的酚，酚/氯仿/异戊醇，25:24:1；氯仿/异戊醇24:1各抽 提一次；每次振荡摇匀，高速离心1Omin抽提过程中要小心，不要吸到有机相）17收集最后水相至新的离心管，加1/1OV的[3M醋酸钠，pH5.2],混匀；用2倍体积的无水 乙醇沉淀，低温（-2OC）放置〉2Omin18•高速冷冻离心1Omin,去上清19.预冷7O%乙醇洗涤沉淀；高速冷冻离心1Omin ；取上清，挥发乙醇；5O^L DDW溶解质 粒。

实验三、酶切与连接一、 实验目的与原理简介限制性内切酶在基因工程中主要应用地以下两个方面：制作基因酶切图谱和进行基因克隆制作基因图谱，就是利用特定 的酶切出特定的条带：而利用基因克隆时选择酶应注意以下几个方面：1）克隆片段的长度；2）克隆片段中切点的情况3）载体 上切点的情况；4）切割与连接方式；5）接头状态酶切方式可分为部分酶切和完全酶切两种：1）部分酶是指同一 DNA片段上有些被切开而另一些未被切开，此法主要应用 于基因 的克隆 用部分酶切法是基于基因内部可能有此酶的位点进行部分酶切可通过两个方式：一是不同的时间内在同 一酶反应管中取样终止反应，利用时间来控制酶切的程度另一种是在其余条件相同时控制酶的稀释度，利用不同酶浓度控制 酶切程度，这种方法因易于控制反应而被广泛应用2）完全酶切法适用于如载体切割、酶切图谱的制作、基因的鉴定与DNA片 段的分离工作完全酶切又可分为单酶切、多酶切两种在多酶切反应中当2种或2种以上的酶有相同的反应条件时，可同时 进行酶切，不然须在前一种酶作用完成后将其失活，。