高效液相色谱法检测酱油中的苯甲酸钠.docx

高效液相色谱法检测酱油中的苯甲酸钠1．原理酱油样品经酸化后，用乙醚提取苯甲酸，定容过滤后进高效液相色谱仪，经反相色谱分离后，根据保留时间定性和峰面积定量2．试剂2.1甲醇:分析纯，经滤膜（HF 0.5Q过滤；2.2 无水乙醚：分析纯；2.3 无水乙醇：分析纯；2.4 6N盐酸：取36〜38%的盐酸500m 1,定容至1000ml；2.5 4%氯化钠溶液：称取40.0g氯化钠，定容至1000ml；2.6 0.02M乙酸铵溶液：1.54g乙酸铵定容至1000ml，溶解后经滤膜（HA 0.45卩）过滤；2.7苯甲酸标准储备液：称取苯甲酸0.1000g加2%碳酸氢钠溶液1ml,搅拌溶解，加水定容到100m l，苯甲酸浓度为1mg/ml；2.8苯甲酸标准使用液：取苯甲酸标准储备液10ml，放入100ml容量瓶中，定容至刻度，苯甲酸浓度为 0.1mg/ml3．高效液相色谱条件3.1 Spectra-Physics 高效液相色谱仪；3.2 色谱柱：Spherisorb 0DS1 04.6mmx200mm；3.3检测器：紫外检测器，波长230nm，灵敏度0.2 AUFS；3.4流动相：甲醇:0.02M乙酸铵（5： 95）；3.5 流速： 1ml/min；3.6进样量：10山；3.7允许差：相对误差W10%。

4．操作方法：4.1 样品预处理：称取均匀的酱油样品5.0g放入125ml的分液漏斗中，加入6N盐酸1ml 酸化，用15、10ml无水乙醚萃取两次，合并乙醚放入125ml分液漏斗中， 用 4%的氯化钠溶液约 10ml 分别洗涤两次，将洗涤后的乙醚移入 80ml 蒸发皿 中，温水浴挥干，分别用 10ml 无水乙醇洗涤蒸发皿两次，放入 100ml 容量 瓶中，再用蒸馏水洗涤蒸发皿两次，并入上容量瓶中，用蒸馏水定容至刻 度，用0.45卩(HA)滤膜过滤，供高效液相色谱测定用4.2 测定操作：开机预热 30min 并对流动相进行脱气操作，待流动相流速恒定及检测器 稳定后，用25山微量进样器吸取供试液进样，绘图积分，得供试样品的吸收 峰面积，并进样测定苯甲酸标准吸收峰的面积，根据计算公式算出样品中苯甲酸的含量4.3 计算公式：A x Cio1C. 一ix nx—Aom式中Ci——样品中苯甲酸的含量；Ai——测定样品的吸收峰面积；Co——配制的标准苯甲酸溶液的浓度; Ao——标准苯甲酸溶液的吸收峰面积; n ——测定样品的稀释倍数； m 测定样品的质量5. 实验数据：5.1实验操作过程的重现性测试：取均匀的金标生抽王样品，分装成五份，每份5.0g，按上述的样品预处 理方法分别进行萃取操作(每次萃取操作尽可能完全一致)，得五个待测样 品，分别进样检测，用外标峰法确定苯甲酸的含量。

五次萃取操作数据比较 如下表：表 1 ．实验操作重现性数据表样品编号12345苯甲酸标准(0.1mg/ml)样品质量(g)5.005.005.005.005.00/吸收峰面积(IO4)A129.2110.5111.098.3117.3490.7A2101.4112.191.1117.0115.3111.3101.198.3117.2样品中苯甲酸 含量(g/kg)0.4700.4540.4120.4010.478/样品中苯甲酸 平均含量(g/kg)0.443/相对误差(％)6.12.4-7.0-9.56.1/结论：从表中可知，连续五次同样的萃取操作所得的结果都较为接近，相对误 差在允许范围 10%以内，完全符合标准要求，因此，从实验操作过程的重现 性来分析，用该操作方法测定苯甲酸的含量是稳定可行且符合标准要求的 5 .2高效液相色谱仪进样的重复性(稳定性)测试：取 0.1mg/ml 苯甲酸标准使用液，用 25 l 微量进样器进高效液相色谱仪 , 绘图积分,测出苯甲酸的吸收峰面积,以同样的操作手法连续进样 6次,将各次 的吸收峰面积数据比较如下表：表2.高效液相色谱仪稳定性测试数据表:进样编号123456吸收峰 面积(104)452.0424.5452.4465.8450.6431.9平均吸收峰面积(104)446.2相对误差(％)1.3-4.91.44.41.0-3.2结论：由上表数据可知，连续 6次进样所得的实验结果都十分接近，相对误差 在允许范围 10%以内，因此，从仪器稳定性方面考虑，本实验所用的高效液 相色谱仪作为测定苯甲酸含量是符合标准要求的。

5.3 苯甲酸浓度——吸收峰面积的线性关系实验:分别配制 0.1mg/ml、0.05mg/ml、0.01mg/ml、0.001mg/ml 的苯甲酸溶液，分别进高效液相色谱仪测定吸收峰的面积，得数据如下表:表3.苯甲酸浓度一一吸收峰面积关系表:苯甲酸的浓度 (mg/ml)0.0010.010.050.1吸收峰119.862.8294.3537.7面积(104)220.069.0293.6541.0319.266.3286.0560.1吸收峰平均 面积(104)19.766.1291.3546.3结论： 由上面所作的“苯甲酸浓度——吸收峰面积关系曲线”可以看出，在苯 甲酸浓度比较接近的范围内，样品的吸收峰面积与苯甲酸浓度成正比的线性 关系5.4 乙醚萃取苯甲酸的回收率测试：样品A （不加标准样）：取金标生抽王样品5.00g，按照上述的样品预处样品B （加标准样）理方法得样品A （不加标准样）取金标生抽王样品5.00g，加入O.OlOOg苯甲酸, 溶解后按样品预处理方法得样品B（加标准样）做两组相同的样品A和样品B,分别测定回收率，数据如下表:表 4 ．乙醚萃取苯甲酸的回收率数据表：样品A1B1A2B2金标生抽样品 质量(g)5.005.005.005.00加入苯甲酸 的质量(g)/0.0100/0.0100吸收峰面积(104)1144.3605.8118.0614.32123.5609.0117.0575.13149.6609.4117.3579.1平均吸收 峰面积(104)139.1608.1117.5589.5苯甲酸标准 吸收峰面积(104)490.7490.7回收率(％)95.696.25.5 自来水空白萃取实验及最低检测量的测试：取 5.00g 自来水作为空白样品，按样品的预处理方法进行萃取操作，测定其色谱吸收峰面积；取5.00g苯甲酸溶液(lmg/1000ml),按样品的预处理方法进行操作，测定其色谱吸收峰面积，所得的实验数据如下表：表 5 ．自来水空白及最低检测量测试数据表：样品自来水空白1mg/1000ml苯甲酸溶液吸收峰面积(104)1未检出1.692未检出1.54结论：由实验结果可知，自来水中未检测出苯甲酸，因此它对本实验没有影 响；而含量为 1mg/kg 的苯甲酸经萃取可在仪器中检测出，因此本实验操作 及仪器的最低检测下限为 0.001g/kg.。