菌菌膜形成突变株的筛选.pdf

上海交通大学硕士学位论文单核细胞增生李斯特菌菌膜形成突变株的筛选姓名：马瑜丹申请学位级别：硕士专业：食品科学指导教师：史贤明20080201上海交通大学硕士学位论文 VI 单核细胞增生李斯特菌菌膜形成突变株的筛选 摘 要 单核细胞增生李斯特菌是重要的食源性致病菌， 它具有形成菌膜的特性 通过对功能和调控基因的研究来探讨单核细胞增生李斯特菌菌膜的形成机制，可望建立防治该细菌污染食品的方法 本文使用电转化的方法，将携带转座子 Tn917 的质粒 pTV1-OK转化到单核细胞增生李斯特菌中，并诱导转座，获得了 1880 多个突变株，加上本实验室前期构建的突变株，使实验室单核细胞增生李斯特菌 Tn917 转座突变株库增加到 2200 株 本文使用96孔细胞培养板对随机挑选的1000余株突变株进行菌膜培养培养后的 96 孔细胞培养板清洗后用结晶紫染色，测 OD595值来表示菌膜形成量的筛选依据， 从而挑选到菌膜形成能力变小的突变株 8 株，目标突变获得率约为 8‰对筛选出的菌膜形成量变小的突变株进行荧光显微镜观察， 证实该 8 株突变株菌膜形成能力弱于野生菌株 最后通过 PCR 验证， 证明这 8 株突变株的基因组中有 Tn917的插入，这可能是它们表型发生变化的原因。

以所突变株 LM-301 基因组 DNA 为模板，采用 IPCR（inverse PCR） 方法扩增插入位点旁侧基因， 将 IPCR 产物片段测序及 BLASTn比对，结果显示该基因可能编码细胞表面锚定蛋白 关键词：单核细胞增生李斯特菌，Tn917，菌膜，IPCR 上海交通大学硕士学位论文 VII THE SCREENING OF LISTERIA MONOCYTOGENES MUTANTS ON BIOFILM FORMATION ABSTRACT Listeria monocytogenes is one of the most important foodborn pathogens. Characterization of the functional genes and related regulation elements is the basis to understand the mechanism of bacterial biofilm formation, which is important for the development of prevention methods to the bacterial pollution. The transposon Tn917 was used to produce insertional mutagenesis of L. monocytogenes by electroporation and transposition, and 1880 mutants were obtained in this study, which extended the mutants in our lab to the total amounts of 2200. A thousand of mutants was screened for the negative mutation on biofilm formation by crystal violet staining analysis after microtiter incubation. Eight strains with poor ability to form biofilm were finally sorted out, and the rate of targeted mutation amounts was estimated as 8‰. The poor ability on biofilm formation of these mutants was further confirmed by fluorescence microscopy. It was also confirmed by PCR assay that the mutation was generated by the insertion of Tn917 into the genomes of those targeted mutants. The genomic DNA of mutant LM-301 was involved in the analysis of IPCR ( inverse PCR), which indicates the interrupted gene segment. 上海交通大学硕士学位论文 VIII The DNA sequencing and GenBank alignment results showed the gene encoded the cell wall surface anchor family protein. KEY WORDS: Listeria monocytogenes, Tn917, Biofilm, IPCR 上海交通大学硕士学位论文 i 英文缩略语索引 Abbreviation 英文缩写词 英文全名 中文全名 amp Ampicillin 氨苄青霉素 BHI Brain Heart Infusion 脑心浸液 BLASTn Basic Local Alignment Search Tool- nucleotide sequence 将待查询的核酸序列及其 互补序列一起对核酸序列 数据库进行查询 bp Base pair 碱基对 BPW Buffered peptone water 缓冲蛋白胨水 cfu colony forming unit 菌落形成单位 CTAB Hexadecyl trimethyl ammonium Bromide；Cetrimonium Bromide十六烷基三乙基溴化铵 DNA Deoxynuckeoside acid 脱氧核糖核苷酸 dNTP Deoxynuckeoside triphisphosphate 脱氧核苷三磷酸（四种） EB Ethidium bromide 溴化乙锭 EDTA Ethylene diamine tetraacetic acid 乙二胺四乙酸 EPS exopolysaccharides 微生物胞外多糖 erm Erythromycin 红霉素 FITC Fluorescein isothiocyanate isomer I 异硫氰酸荧光素酯 HEPES 4-（2-Hydroxyethyl） -1-piperazineethanesulfonic acid 4-羟乙基哌嗪乙磺酸 IPCR Inverse Polymerase Chain Reaction 反向 PCR IPTG Isopropyl β-D-1-Thiogalactopyranoside 异丙基-β-D-硫代半乳糖苷kan Kanamycin 卡那霉素 LB Luria-Bertani medium 基础培养基 PBS phosphate buffered solution 磷酸盐缓冲液 PCR Polymerase Chain Reaction 聚合酶链式反应 PEG Polyethylene Glycol 聚乙二醇 RNA Ribo Nucleic Acid 核糖核酸 rpm round per minute 每分钟转数 SDS Sodium dodecyl sulfate 十二烷基磺酸钠 Taq Thermus aquaticus 水生栖热菌 上海交通大学硕士学位论文 ii 续 英文缩略语索引 英文缩写词 英文全名 中文全名 TE Tris-EDTA buffer TER 含无 DNA 酶的 RNA 酶 TE 溶液 Tm Melting temperature 熔解温度 Tris Trihydroxymethlamino-methano 三羟基甲基氨基乙烷 TSB Tryptic Soy Broth 胰蛋白酶大豆肉汤 UV Ultraviolet 紫外光 上海交通大学硕士学位论文 III 上海交通大学上海交通大学 学位论文原创性声明学位论文原创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立进行研究工作所取得的成果。

除文中已经注明引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的作品成果 对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明本人完全意识到本声明的法律结果由本人承担 学位论文作者签名：马瑜丹 日期： 2008 年 2 月 25 日 上海交通大学硕士学位论文 IV 上海交通大学上海交通大学 学位论文版权使用授权书学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅 本人授权上海交通大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文 保密保密□，在 年解密后适用本授权书 本学位论文属于 不保密不保密□√√ （请在以上方框内打“√√” ） 学位论文作者签名：马瑜丹 指导教师签名：史贤明 日期：2008 年 2 月 25 日 日期：2008 年 2 月 25 日 上海交通大学硕士学位论文 1 1 绪论 1.1 菌膜的重要性与研究进展 1.1.1 菌膜的定义 细菌在一定条件下吸附在特定表面并增殖形成膜状结构， 这种吸附群体称为菌膜（biofilm）[1]。

它是细胞间相互协调，并以多细胞群体形式组成的群落结构目前，人们对细菌的生活方式有两种认识：一是自由运动的游离细胞状态，另一种就是积聚附着于物体表面的相对稳定的群落状态两种状态并不是孤立存在，细菌以游离的状态移动传播，但是以固着的状态生存繁衍，两种方式可以相互转换，因为菌膜有很强的抵抗逆境的能力，甚至可以说，菌膜是细菌适应不利的生长条件的表现 1.1.2 菌膜的形成 对于菌膜的形成，目前比较公认的模型是吸附－聚集－增殖－扩散 首先在形成菌膜的过程中，必须有吸附到固体的表面上的细菌吸附过程受各种因素的影响，液体环境中的表面基质、流体动力学都会影响细菌的吸附多数研究表明，细菌在疏水和无极性的表面上比在亲水的和极性表面上更容易吸附，这是因为细菌表面的疏水物质能够与其它的非极性物质发生作用，从而影响细菌的吸附虽然大部分细菌表面是带负电荷的，但是细菌表面还是有许多疏水物质，如伞毛，绝大多数的伞毛都带有高比例的疏水氨基酸残基[2]，能够突破细菌表面与其它物质之间的电荷障碍[3]，因而有利于细菌的吸附Korber[4]等人通过比较研究运动细菌和不运动细菌发现， 鞭毛在细菌的早期吸附当中有着重要的作用，鞭毛能够抵抗菌体与基质表面之间的脉冲力。

在研究革兰氏阴性菌（大肠杆菌、铜绿假单胞菌、荧光假单胞菌、霍乱弧菌等）菌膜形成机制时发现，细菌的运动能力对菌膜的形成有很大的关系， 深入研究发现是缺少动力的细菌无法形成单层的菌膜，进而无法形成三维的菌膜这主要是由于缺少鞭毛以及菌毛的菌株无法介导细菌的最初吸附到固体表面 吸附在物体表面的细菌，通过分泌胞外多糖、蛋白等物质使细菌聚集，并牢上海交通大学硕士学位论文 2 固的附着至物体表面细胞表面的蛋白类物质对于细菌的吸附有着重要的作用，有人用蛋白酶处理菌体后，发现细菌的吸附能力大大减少[5]在对大肠杆菌菌膜形成的研究中发现，特定的外膜蛋白对形成菌膜有着重要的作用这些外膜蛋白主要包括组成菌毛的主体蛋白 FimA，菌毛粘附素（pilus adhesin）Fi。