三重实时荧光PCR相对定量法快速诊断21三体及-第三军医大学学报.doc

请精减全文，压缩全文至4000个字符数内控制在此排版格式下最多2. 5个页面，2个页面最好三重实时荧光PCR相对定量法快速诊断21三体及脆性X综合征刘彦慧"，周万军彳,吴亚敏黎丽芬李超强'（523110广东东莞,中山大学附属东莞东华医院医学遗传学实验室510515 广州，南方医科大学基础保学院遗传学教研室J问题1： 3是什么单位？［摘要］目的建立三重TaqMan实时荧光PCR技术方法，检测21、X染色体非整倍体方法以21号染色体唐氏综合征特 杲区域（DSCR3）为21号染色体目的基因，选取X染色体1113K—段DNA序列作为X染色的冃的基因，同时选择12号染色体上 的磷酸"油醛脱氢酚基因（创吻力为参照棊因，设计合成3对引物以及分别以不同荧光标记的TaqMan探针，在同一反应管 中进行扩増,以相对定ffiACt值鉴别21号和X染色体非整倍体并进行PCR反应体系优化以及优化后参数设定和扩増效率筹 指标的评价，采用建立的技术检测临床标本并进行评价结果通过优化，门的基因和参照基因扩增效率基木一致，接近 100%,模板量在100〜600 ng g （问题2：请核实是笔谋吗?止文中还有一处/u 1时3个基因都可以得到有效扩增。

采 用上述体系检测24例正常标本和20例异常标本（包括血液和羊水标本），正常标本的21号ACI值均为2,而唐氏综合症患者 均为3；正常男性的X染色体ACttfi均为1,而正常女性均为2其临床标本检测结果的敏感性、特并性、准确率均达百分之 Ho结论建立的三重实时荧光PCR相对定量法快速诊断21三体及脆性X综合征的技术，稳定性、可靠性和实用性均较好［关键词］三重实时荧光PCR技术；唐氏综合征；非整倍体［中图法分类号］ ［文献标志码］B［通信作者］? ?,：（）？ ？ ？ ，E-ma订： ？ ？ ？项目名？正义反义项目Chroin215，-CATCCATTAGC.UGTCAGAGGTTTC-3'5* GAAAACATTGACTGTGGCTCTTG-3'FAM（ChromX5' -CAATGCGGGAGCGATG-3，5f -CCHCCTGTGTCTGTCGGTG-3'HEX-cGAPDH5' -GCCTAGGGCTGCTCACATATTC-3 *5f -CGCAACAATATCCACTTTACCAGAG-3ROX-c表1目的及参比基因引物、TaqMan探针染色体异常是导致先天畸形的重要原因，畸形胎 儿染色体核型异常的比例位丁各类产前诊断指征的第1 位—传统的染色体病产前诊断方法是细胞培养，稳定 性与可靠性较髙，可对染色体数目和结构进行分析，但 存在实验过程较氏、操作繁琐、检测通量小，仅能分 析中期染色体等缺点。

因此，开发新的高特异性和灵敏 性、经济省时的检测方法是染色体病研究工作中的重 点本研究即应用三重TaqMan实时荧光PCR技术，对21、 X染色体拷贝数进行相对定量，以期实现其快速诊断， 满足大规模临床检测应用1材料与方法 1.1对象20例正常人（男性10例，女性10例）、10例牌氏综合征患者、 5例Turner综合征患者、5例克氏综合征患者外周抗凝血标本各 1.0 ml,采自中山大学附属东莞东华医院（问题3：收集时间？）, 均经染色体G显带分析证实用酚氯仿法抽提基W^DNA, -20 °C 保存备用，另选择孕中期羊水标本6例，其中4例正常（细胞培养 结果为均为46, XY）, 2例唐氏综合征患者（47, XY, +21和47, XX, +21 各1例）问题4：这里交待一共46例，为何表2和讨论中均提及为 44例？1.2引物及探针设计合成参照文献［2］,于21号染色体的唐氏综合征特异区域选择 DSCR3 基因（Downs syndrome critical region gcne3）为目 的基因，扩增产物长度为132 bp；选取X染色体1113K （问题5： K 是什么?是kb的意思吗? ） （ribosomal protein L21 pseudogene 21） —段DNA序列作为X染色的目的基因,扩增长度为147 bp；同 时选择12号染色体上的磷酸甘汕醛脱氢酶基因（glycera 1 dehyde-3-phosphate dehydrogenase, GAPDII）为参照 基因，扩增产物长度为150 bp （相应引物^TaqMan探针见表1）。

以上引物及探针由上海生工生物工程技术服务冇限公司合成问题6：核实表1的修改，并按要求进行修改改为三线表或 建议直接用文字进行敘述1.3三重TaqMn实时荧光定量PCR体系优化根据2-厶△ Ct法相对定屋的方法学要求［3］,在验证了各个PCR反应的特界性之后•必须对三重TaqMan实时荧光定量PCR体系 进彳亍了优化，以保证3个PCR反应效率基本一致本研究中，针对 PCR反应体系中的Buffer.镁离子、引物、探针、dNTPs等成分的 浓度均进行了一系列优化［4］,以保证方法学的可行性取一正 常人gDNA （问题7：请核实）为模板，以加入模板量为50、100、 200. 400. 600. 800、1000、1200、1400> 1600 ng的浓度梯度, 以标准品模式进行检测，仪器111动计算斜率及扩增效率；同时， 以手工方式，计算Mt,评价扩增效率的i致性1.4三重TaqMn实时荧光定量PCR分析参数设定及样本检测三重TaqMan实时荧光定量PCR采用Stratcgenc 3005p型PCR 仪（美国Agilent公司）反应体系20 ul,含模板DNA 100〜600 ng, 2对引物各200 nmol/L,相应TaqMan探针各 100 nmol/L, 10 XEx Taq Buffer 3 u 1, Ex Taq 1. Ou （问题8：请核实? ） , Mg2+ 5.0 mmol/Lo 热循环条件为:95 °C 10 min,然后95 °C 20 s,60 °C 1 min,循坏30次。

仪器附带软件自动计算Ct值1.5数据分析根据2-厶△ Ct法相对定量学计算方式对标本的相对拷贝数 进行计算，然后根据拷贝数结杲进行分子诊断2结果2.1三重TaqMn实时荧光定量PCR体系优化及扩增效率评价经优化调整,于］.5XPCR Buffer. 5 mniol/L Mg2+的反应体 系，3个PCR反应的斜率分别为-3・217（Chrom21）、3. 273（ChromX） 和-3.218（GAPDH）,均接近一3. 32,表明具有接近100%的PCR扩 増效率（图1）同时，按Act=ct n的基M-ct参比基因进行计 算，以加入模板量为横座标，为纵朋标，绘图并计算斜率， 斜率越小,说明此3个PCR反应之间扩增效率一致性越高,本研究 中，两H的棊因的斜率均为0. 0001,说明此体系中扩增效率一致 性较高（图2）,满足采JIJACTffi法进行相对定量分析的要求2.2最佳检测模板量范围的确定根据扩增效率相关数据及曲线分析，模板量在100〜600 ng g （????）/□】时，扩增曲线平滑，指数期明显,3个基因都可 以得到有效扩娩并II不同浓度的扩增曲线平行性好，故选取此 范围为检测模板量最佳范用。

2. 3临床标本检测将5例正常男性（问题11：为何选5例？）棊因组D\'A混合（0.2 H g/nl）作为止常参照DM标木，采用所建立的三重Taq'km实时 荧光定量PCR反应体系，丁•某TCR检测反应中同时检测待检DNA 及参照DNA标木,然后按下列公式进行计算：同一标木目的基因 ACt=CtH的棊因一Ct参比棊因，待检标本某H的棊因 =Act待检标4：-Act参照标本，然后再计算待检标本某n的基 因的2 — △△CtffU如果2 — AACt = l,则说明此待检测标木目的 基因与正常参照标本的基因拷贝数Z比为1,也就是如果正常参 照标本的相对拷贝数是2,则待检标本的相对拷贝数也为2 （具体 计算方法参照文献［5］）问题12：此段询3句话是否为“方法” 的内容？是否应该放在“材料与方法”的恰当位置？临床标本 检测结果的敏感性、特异性、准确率均达百分Z百但验证此方 法的准确率仍需扩大样本量进行检测临床标本检测结果见下表 2,各拷贝数统计图见图3问题9：补充横纵朋标中文标廿及单位，并请解决横朋标不等距的问题 问题10：补充横纵朋标中文标H及单位图1三^TaqMan实时荧光定量PCR体系各PCR反应扩增效率分析 图2三STaqMan实时荧光定呈PCR休系扩増一致性评价（斜率越小，扩增效率一致性越高）表2 Chrom21. ChromX数目异常及正常标本相对拷贝数定星检测结果（包括6例羊水标本）46. XY•16,；'：47, XY, +2147. XX, +2145, X047, XXY例数14107553目的基因21X21X21-21\21X21X也1.01±0. 150・47±0・ 08L06±0. 181.04±0.091.52±0. 100.51±0. 131.49±0. 111.02±0. 131.02±0. 080. 53 士 0. 130.98 ±0. 110. 97 ±0. 12相对拷贝数122:;1；＞22122问题13：将表2改为三线表，且此表主谓颠倒，请修改。

例数问题44 or 46?图3 ChromX、Chrom21相对拷贝数为1、2或/和3时的2 — AACt值 问题14：补充横纵塑标中文标H及单位问题15:结果中3个图质量都不是很好，请尽量提供质量好的图片能否对图片进行删减?3讨论冃前对于绝大多数出生缺陷都缺乏有效的治疗方 法，所以，及时准确的产前诊断是唯一有效的防止畸形 儿出生的技术乎段现已知早孕期流产中50%以一上是因 为染色体并常造成,其中染色体数口卅常占到了整个染 色体异常的86%,其中包括三体熨、单体型以及多倍体 （三倍体、四倍体等），而染色体结构异常只占到了6% , 其他界常如单:基因突变和镶嵌体等占8%左右同所以， 及时、快速诊断染色体数冃异常，就意味着将防止86% 染色体界常胎儿出生，有着重要的现实意义口前进行 染色体数口界常的诊断方法主要是细胞遗传学方法，但 其存在细胞培养、耗时长、影响因素多、工作量大等诸 多因索，建立与开发操作简单、方便，省时省力，易于 实验自动化的方法，是当前的现实需要木研究小所采 用的三重TaqMan实时荧光定量PCR体系，可于一管同时 检测21号及X染色体非整倍体，敏感性、准确率高，丄L用 材少，无须细胞培养，2彳〜48 h就可以得出结果,适于大 规模产前诊断及临床应用。

本研究的实验设计中，所选择的21号染色体扩增片 段及GAPFDH参比基因，已有相关文献报道⑺，此基因于 人群中无拷贝数变异多态性，具有可靠的代表性所选 择的X染色体扩增片段，虽然在实验过程中，尚未发现 正常人群中的拷贝数变界多态性，但其最终验证尚需人 规模的人群筛查检测，此工作有待完善另外，木法只 能对待检标本中拷贝数的变化进行诊断，但对是否易位 型、嵌合体，还是游离型染色体数冃异常，尚不能判断 此三重TaqMan实时荧光定量PCR体系，不但是于同一反 应中扩增两个冃的基因，同时，为了标准化加入体系中 的DNA量，通常在反应中还扩增一内参照基【丿、I作为相 对定量的体系，引物及探针的稳定性、特异性、Z间的 结。