叶酸的测定方法.docx

叶酸的测定方法微生物法1. 原理叶酸是酪乳酸杆菌（Lactobacillus casei, L. C, ATCC 7469）生长所必需的营养素在一定条 件下，L.C的生长繁殖与培养基中叶酸含量呈正比关系，细菌增殖的量以光密度值计，通过 与标准曲线相比较，计算出样品中叶酸的含量2. 适用范围参考《Methods of Vitamin Assay》，第4版本方法适用于各类食物中叶酸的测定检测限 为 0.1ng3. 仪器与设备（ 1） 恒温培养箱（2） 离心机（ 3） 高压消毒锅（ 4） 震荡器（ 5） 接种针和接种环（ 6） 分光光度计4.试剂除特殊说明外，本实验中所有试剂均为分析纯，水为蒸馏水1） 菌种：酪乳酸杆菌（Lactobacillus casei, L.C, ATCC 7469）（2） 磷酸缓冲液（0.05mol/L, pH6.8）:称取 4.35g Na3PO4・12H2O,10.39g Na2HPO4・7H2O 溶解 于800ml水中临用前用约5g抗坏血酸调节pH至6.8注：叶酸对光、热敏感，易被氧 化破坏，抗坏血酸有助于保护叶酸被氧化3） 鸡胰酶溶液：称取100mg干燥的鸡胰酶（Difco公司）（注：含有叶酸轭合酶，用于 水解叶酸多谷氨酸盐），加入20ml磷酸缓冲液制成匀浆，3000rpm离心10min,取上清液备 用。

临用前现配4） 蛋白酶-淀粉酶溶液：分别称取200mg蛋白酶（Sigma公司）和淀粉酶（Sigma公司）， 加入20ml磷酸缓冲液制成匀浆，离心3000rpm 10min,取上清液备用临用前配制5） 2+8乙醇溶液：量取20ml无水乙醇溶液，加入80ml水混匀6） 01mol/L NaOH:称取0.4g氢氧化钠，加2+8乙醇溶液溶解并稀释至1L7） 10mol/L NaOHo称取400g氢氧化钠，加水溶解并稀释至1L8） 叶酸标准储备液（200mg/ml）:准确称取200mg叶酸标准品（Sigma公司，纯度大于98%），用O.Olmol/L NaOH溶解并定容至IL储存于棕色瓶中9） 叶酸标准中间液（200ng/ml）:准确吸取1.0ml叶酸标准储备液，用0.01mol/L NaOH溶 解并定容至1L储存于棕色瓶中标定：准确吸取lml叶酸标准中间液，用0.1mol/L NaOH定容至10ml以0.1mol/L NaOH 调零点，比色杯厚度lcm,波长256nm，测定3次紫外吸光度值，取平均值，按下式计算标 准中间液浓度公式（略）式中：X1 --叶酸标准中间液浓度， ng/ml； A --标准中间液平均紫外吸光度值；E -- 摩尔消光系数 24,500；M -- 叶酸分子量 441.42；10-- 测定紫外吸光度值时的稀释倍数；106 -- 由 g/L 换算成 ng/ml 的换算系数。

10） 叶酸标准工作液（0.2ng/ml）:准确吸取1.0ml叶酸标准中间液，用磷酸缓冲液稀释定 容至 1L11） 2.4mol/L HCl:量取20ml浓盐酸，加水稀释至100ml12） 酶解酪蛋白溶液:将8g碳酸氢钠溶解于1L水中，加入60g去维生素酪蛋白（Sigma公 司），用10mol/L NaOH调节pH至8.0 （调pH时应小心，不要过碱后再加酸反复调节，避 免酪蛋白结块）加入300mg胰酶，搅拌20min,使胰酶混匀充分再加入2.5ml甲苯，置 37°C恒温箱酶解48〜72h （此步骤是将酪蛋白酶解为L.C可以利用的小分子肽酶解时间不 易超过72h，如时间过长，配成的培养基不利于细菌生长）将酪蛋白液从恒温箱中取出， 121C高压30min以终止反应并去除甲苯冷却，加10g硅藻土搅拌，用垫有滤纸的布氏漏 斗过滤向滤液中加入约60ml冰乙酸调节pH至3.7称取活性炭12g，加入滤液中搅拌10min， 用布氏漏斗过滤，重复三次每次过滤时，布氏漏斗内加有 10g硅藻土协助过滤最后滤液 用水稀释至1200ml，4C冰箱保存1年（活性碳可吸附酪蛋白中的叶酸以减少试剂空白，同 时也可吸附肽及氨基酸，应注意控制搅拌时间）。

取10ml酶解后的酪蛋白溶液加入已称重 的蒸发皿中，沸水浴蒸发至干将蒸发皿置于100C恒温烤箱内干燥至恒重，在干燥器中冷 却至室温称量蒸发皿的重量，蒸发皿内固体重量，如固体重量小于400mg，即每毫升酪蛋 白溶液中固体含量＜40mg，贝9弃除酪蛋白液，重新制备13) 黄嘌吟溶液：取0.4g黄嘌吟，加入10ml氨水，加热溶解，用水稀释至100ml冰箱 保存14) 腺嘌吟-鸟嘌吟-尿嘧啶：分别称取硫酸腺嘌吟，盐酸鸟嘌吟和尿嘧啶各0 .2g ，加入2.4 mol/L HCl溶液10 ml,加热溶解，用水稀释至100ml,室温贮存15) 乙酸缓冲液(1.7mol/L,pH4.5)： 38.65g无水乙酸钠，19.8ml冰乙酸，加水稀释至500ml16) 维生素溶液：取10mg核黄素溶解于40 ml乙酸缓冲液中取0.2mg生物素，2.5mg NaHCO3， 20mg 对氨基苯甲酸， 40mg 盐酸吡多醇， 4mg 盐酸硫胺素， 8mg 泛酸钙， 8mg 尼克酸溶解于 50ml 水中将上述两种溶液混合，加水至 100ml17) 吐温-80溶液：将2g吐温-80加入100ml 45°C水中，混匀18) 还原型谷胱甘肽溶液：取0.1g还原型谷胱甘肽，加水至100ml.(19) 甲盐溶液：称取5g磷酸氢二钾和2g磷酸二氢钾，加水溶解至100ml,液面上加入 少许甲苯保存。

20) 乙盐溶液：称取2 g硫酸镁，0.5 g硫酸亚铁和0.5 g硫酸锰，加水至100 ml,液面上 加少许甲苯保存 21 ) 基础培养基：按下表配制，最终定容至 500ml酶解酪蛋白 100ml L-盐酸半胱氨酸 0.2 g腺嘌吟-鸟嘌吟-尿嘧啶 2.5ml 色氨酸 0.2 g黄嘌吟溶液2.5ml 还原型谷胱甘肽溶液 2.5ml维生素溶液5ml葡萄糖20 g吐温-80溶液2.5ml乙酸钠20 gL-天冬氨酸0.3 g甲盐溶液2.5ml加水至250 ml,搅拌，用10mol/LnaOH溶液调节pH 6.8±0.1,然后加入乙盐溶液2.5 ml,磷 酸缓冲液200 ml,用水补至500 ml4C冰箱内可保存一周甲、乙盐混合后易产生沉淀，所以配培养基时不可同时加入，加入甲盐后先调节pH再加 入乙盐基础培养基也可直接选购DIFCO公司生产的叶酸测定用培养基)( 22) 琼脂培养基：葡萄糖 1 g 甲盐溶液 0.2ml蛋白胨 0.8 g 乙盐溶液 0.2ml酵母提取物干粉 0.2 g 琼脂 1.2g乙酸钠(NaAc・3H2O) 1.7 g加水至100 ml,置水浴煮至琼脂完全熔化，调节pH 6.8±0.1。

尽快倒入试管中，每管3〜5 ml, 塞上棉塞，121°C高压灭菌15 min,取出后直立试管，冷却至室温.于冰箱内保存5. 菌种制备与保存(1) 储备菌种的制备：将L.C纯菌种转接至2个或多个琼脂培养基管中°37C±0.5 C恒 温培养箱中培养16〜24 h贮于冰箱内，每周转种一次留作储备菌种2) 种子培养液的制备：取2 ml叶酸标准使用液和10 ml基础培养基，混匀，分装至4支 5 ml离心管中，塞上棉塞，121C高压灭菌15 min，实验时现制6. 操作步骤所有操作均需避光进行6.1 样品制备(1) 强化剂型样品：称取0.1〜0.5 g样品(约含叶酸100〜300 ng)于100 ml锥形瓶中， 加入50 ml磷酸缓冲液，混匀121C高压水解15 min定容至100ml,过滤2) 果蔬类：称取样品0.2〜2 g (约含叶酸100〜300 ng)，加磷酸缓冲液经高压水解后过 滤，残渣用同样缓冲液再次高压，过滤合并两次滤液，定容至100ml3) 谷、肉、蛋、鱼、豆、奶类等富含淀粉和/或蛋白类样品：称取样品0.1-2 g (约含叶 酸100〜300 ng)，加磷酸缓冲液高压水解后，冷却加入1 ml鸡胰酶和1 ml蛋白酶-淀粉 酶液，1 ml甲苯，充分混合，置于37 C±0.5 C恒温箱内酶解16〜20h。

酶解后定容至100ml 过滤另取一支试管，加入 1 ml 鸡胰酶， 1 ml 蛋白酶-淀粉酶和磷酸缓冲液，作酶空白4) 口服液、饮料、果汁等样品：称取样品0.5〜2 ml (约含叶酸100〜300 ng)，加磷酸 缓冲液高压水解后，冷却，加入1ml鸡胰酶，1 ml甲苯，充分混合，置于37 C±0.5 C恒温 箱内酶解16〜20 h酶解后定容至100ml，过滤另取一支试管，加入1 ml鸡胰酶和磷酸 缓冲液，作酶空白6.2根据样品叶酸含量，将上述滤液用磷酸缓冲液稀释到一定倍数，使叶酸终浓度为0.1〜0.4 ng/ml6.3 样品管的制备：取4支试管，每支试管中分别加入稀释后样品液1.0、 2.0、 3.0、 4.0 ml， 补充水至体积为5.0 ml,加入5 ml基础培养基，混匀同样制作酶空白管6.4灭菌：将以上标准系列管、样品管和酶空白管全部塞上棉塞，121C高压灭菌15 min6.5 标准系列管的制备：取试管分别加入叶酸标准工作液0.0、 0.5、 1.0、 2.0、 3.0、 4.0、 5.0ml, 相当于叶酸含量0，0.1，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0 ng,加水补至体积为5.0 ml,再加5 ml基 础培养基，混匀。

如样品管一样进行灭菌标准系列管进行平行测定6.6 接种（1）接种液的制备：接种前一天，用灭菌的接种针将菌种由储备菌种管中转种至2 支已灭 菌的种子培养液中，37°C±0.5°C恒温培养箱中培养16〜24 h混悬种子培养液，无菌操作下 用接种针管将20滴种子培养液转移至另2支无菌的种子培养液中，37 C±0.5 C再培养6h 震荡混匀，制成菌种混悬液立即使用叶酸是L.C生长所必需的，但是如果培养基中叶 酸含量过高，细菌可在体内贮存，使测定空白值，影响细菌生长曲线将接种液转种再培养 6h,有利于消耗细菌体内贮存的叶酸2）接种：在无菌操作条件下向每支已灭菌的标准系列管、样品管和酶空白管接种一滴上 述接种液（注意应直接滴在培养基内），混匀留一支标准0管不接种，用于测定光密度时 调零6.7培养：置于37 C±0.5 C恒温培养箱中培养20〜40 h6.8测定：用分光光度计，在波长540 nm下，以未接种的标准0管调节零点，测定标准管、样品管和酶空白管的光密度值7. 计算（1） 绘制标准曲线：以标准系列管中叶酸含量为横坐标，光密度值为纵坐标，绘制叶酸标 准曲线2） 结果计算：根据样品管和酶空白管的光密度值，从标准曲线上查得相应的叶酸含量， 按下式计算。

公式（略）式中：X--样品中叶酸含量，卩g/100g；c--从标准曲线上查得样品测定管中叶酸含量， ng；P--从标准曲线上查得酶空白管中叶酸含量， ng；V1--样品制备时定容体积， ml；F--稀释倍数；V2--制备样品测定管时加入的样品液体积， ml；m--样品质量， g；100/1000—样品含量由ng/g换算成卩g/100g的系数8. 注意事项(1) 同一实验室平行测定或重复测定结果相对偏差绝对值＜10%2) 微生物法的测定结果为总叶酸含量3) 微生物法测定叶酸常用的菌种除L.C外还有粪链球菌(Strepto。