体外诊断试剂研制常用技术指标.docx

体外诊断试剂是疾病有效诊治的重要辅助手段依据《体外诊断 试剂注册管理办法》进行该类产品的注册申报，是我国食品药品监督 管理局对体外诊断试剂市场准入的要求疾病的治疗，诊断是第一步，而体外诊断试剂是重要的辅助手段 随着新技术的发展和新疾病靶标的发现，开发新型的体外诊断试剂生 生不息但一个新开发的试剂能否真正面市，除了建立反应模式和体 系并进行优化外，合理的性能分析与评估，是必经的程序，也是质量 保障的基础自从我们开始涉及体外诊断试剂的研制开发，就结合临 床流行病学中诊断试剂评价的有关内容以及国家食品药品监督管理局 对体外诊断试剂注册审评的要求，对研发的体外诊断试剂试验室评价 时的一些实验设计提出一些方案大部分内容在接下来的应用中得到 了肯定，但部分还是存在不清晰或不合理现象为更好地执行新的 《体外诊断试剂注册管理办法》，同时也为了进一步提高研制人员对 相关技术指标的科学涵义及其评价设计的认识，促进注册报批质量的 提高，特整理相关资料，希望对我们的工作有所帮助1 定量标记免疫分析方法分析性能评估的主要指标1.1 灵敏度1.1.1 分析灵敏度：试剂盒的灵敏度即最低检出量是指在统计学意 义上能与零剂量区别的量。

一般用 95％可信限计算：重复测定零剂量 点（n》10）,计算反应量的均值（x）和标准差（SD）,以X+2SD（夹心法试剂盒）或均值x-2SD （竞争抑制法试剂盒）的反应量计算 出相应的浓度，即为该试剂盒的分析灵敏度，这是我们注册资料所需 提供的内容1・1・2功能灵敏度：将低值样本倍比稀释后重复测定（n》10）, 计算反应量的变异系数（CV%）, CV%大于20%时所对应的剂量点， 即为该试剂盒的功能灵敏度1.2 特异性诚如我们所认识到的，标记免疫分析是特定抗体对特定抗原的特异识别不同来源的抗体与结构类似物结合从而产生交叉反应是客观存在的，因此特异性检验是正确认识该试剂盒对结构类似物抗干扰能 力的指标特异性检验通常有两种标定方法：1.2.1交叉反应率：一定浓度的结构类似物在本试剂盒上的测定结 果（物质的量）与该类似物的量的比值的百分率如：1000 pmol/L 的结构类似物，在某试剂盒上测定结果是5pmol/L，其交叉反应率二 5pmol/L/ 1 000 pmol/L * 100%=0.5%1.2.2实际测量值：对于不能用物质的量表示的被测物，如糖蛋白 激素FSH、LH、TSH和HCG,这4种激素具有相同的a亚单位，仅 仅是a亚单位上部分氨基酸不同，实际操作中很容易产生交叉反应， 而这 4 种激素又分别有各自的同形异构物，其量的表达方法还不能用 物质的量（mol/L , ng/mL ）表示，而只能借助于生物测定的活性单 位（ IU/L ， mIU/L ）表示，而每一种激素的活性单位（ IU ）又有完全 不同的生物学意义，相互之间没有任何关联，即并且每一种激素定义 的单位意义完全不同，不同来源相同质量的某一种激素的活性单位也 不同，它们之间的交叉反应绝对不能用交叉反应率表示，因此往往选 择实测值表示。

1.2.3选择交叉反应对照物：当交叉反应的测量结果高于我们期待 的结果时，可以从两个方面分析：首先，该试剂盒抗体确实与这一交 叉反应因子存在交叉反应，如FSH在结构上与另外3种激素仅仅是a 亚单位上个别氨基酸的不同，其特征抗体与其它位点有一定程度的结 合的可能性是存在的，这种非特异结合被限制在一定范围内是可以接 受的在另一方面，如果选择的交叉反应对照物中含有少量的被测物， 如：欲考察FSH试剂盒对LH的交叉反应，选择的LH抗原中含有少 量的FSH，高浓度的这种抗原在FSH试剂盒中的测■结果很可能高于 所期待的结果，应充分认识到这种结果并不是由于FSH抗体的交叉反 应引起的因此，当交叉反应的测■结果高于我们期待的结果时，可 以选择另一来源的交叉反应对照物重新测试，以排除由于抗原不纯而 引起的对该试剂盒抗体交叉反应的误解1.2.4交叉反应物对测定结果的影响：多大的交叉反应是可能接受 的，主要取决于被测物和交叉反应物在人体内的相对含量如 3，5， 3'-三 碘 甲 腺原 氨 酸 （Triindonhyroxine ， T3） 和甲 状 腺 素 仃hyroxine, T4），因为血清中T4的含量是T3的近干倍，所以对于 测量T4的试剂盒而言，与T3存在 10%以下的交叉反应率都不会影响 T4的测定，而如果对于测量T3的试剂盒而言，即使与T4存在1%的 交叉反应率，都会严重影响T3的测定。

1.2.5 其它影响因素：评价试剂盒时还应注意其它因素，如：溶血 高血脂、抗凝剂、其它药物、异嗜性抗体及自身免疫性疾病患者等对 样本测定结果的影响，这种影响对不同方法、不同检测项目的影响程 度是不一样的，应逐一充分认识此部分内容可放入抗干扰能力1.3 剂量－反应曲线建立定量标记免疫分析的最主要特征就是建立剂量－反应曲线，通过 已知浓度的校准物质（自变量，X）和相应的反应量（因变量，Y）建立剂量－反应关系，并同时测量待测品，通过待测样品的反应量（Y'），计算出未知样品的浓度（X'），因此，这种剂量-反应关系需 要有良好的相关性， 即统计学上的 “相 关系数（ r） ”（coefficientcorrelation ），当相关系数越趋近于1时，表明剂量- 反应关系越密切建立剂量－反应曲线时应注意：1.3.1 选择适当的数学模型拟合 如前所述，在评价试剂盒时，我们通常用双对数（适用于非竞争性双位点夹心法标记免疫分析）数学模型和log-logit （适用于竞争法 标记免疫分析）数学模型一般认为，经适当的函数转换后的标记免 疫分析的剂量-反应相关系数或其绝对值（r或|r|）应不低于0.99001.3.1.1 双对数数学模型：顾名思义，双对数数学模型因函数自变 量（剂量）和因变量（反应量）都经对数转换而得名。

自然对数和常 用对数对剂量■反应曲线的影响仅仅在于截距（A）的不同，通常我们 取自然对数：lnY=A+B*lnX大量的经验表明：多数夹心法标记免疫 分析（特别是微量或超微量分析，小于 10－9 克）经双对数函数转换 后，相关系数都能大于 0.9900；对于微克级的被测物，选择半对数函数有时能得到更好的相关系数1.3.1.2 log-logit学模型：经验表明，对于抑制法标记免疫分析，log-logit学模型因其计算方法相对简单，且大多数情况下可以得到较好的相关性，因此是评价这类试剂盒的首选数学模型方程式：logit Y=A+ B*log X,式中:logitY二B/BO /（ 1- B/BO）对于这类试剂盒，还应要求有效剂量值（ED25、ED50、ED75或 ED20、ED50、ED80）应在剂量-反应曲线最高浓度点和最低浓度点 之间，即25% （或20% ）结合率（B/B0% ）所对应的剂量浓度点应小 于曲线最高剂量点，75%或（80% ）结合率（B/B0% ）所对应的剂量 浓度点应大于曲线最低剂量点，使曲线在规定的剂量范围内有足够的-1-1 /落差1.3.2标记免疫分析在选择了特异抗体对特异抗原的特定识别以后，匚二］剂量－反应曲线在适当浓度的抗原、抗体配伍下，在一定范围内，应呈现良好的相关性，相关系数或其绝对值（r或|r|）应不低于0・9900。

否则应从如下几个方面考虑：① 抗体的浓度是否与抗原浓度相适应；② 选择的剂量范围是否合适；③ 选择的函数方程是否合适1.4精密度评价精密度是考察试剂盒对同一样本重复测定时能否得到相同实验结 果的能力的指标，通常用重复多次样本测量结果的变异系数（ CV%） 表示，精密度评价是质量控制的重要内容孔板1.4.1分析内（intra assay）精密度：同一次实验内（同一块上或实验条件完全相同的情况下）同一样本（如：质控血清）重复测 定（n》10）,测定结果的变异系数（CV%）应不高于10・0%分析内 精密度的变化或异常升高，应从方法学改进、实验室条件改变、操作 失当等方面排查原因1.4.2分析间（inter assay）精密度：分析间精密度涵盖的内容非常 广泛，至少应包含入下内容：同一试剂盒，不同批次之间；同一试剂盒，同一批次，不同实验室之间；同一试剂盒，同一批次，同一实验室，不同操作者之间；同一试剂盒，同一批次，同一操作者，有效期内不同时间之间等不同层次的分析间精密度的意义不尽相同，在评价试剂盒质量时 应引起质量控制工作者的足够认识评价分析间精密度时，同一样本（如：质控血清）在上述条件下重复测定（一般n >10）,测定结果的 变异系数（CV% ）应不高于15.0%。

1.5 准确性评价准确性评价通常指测量结果趋近于真值的程度但是，正如我们 所认识到的，对于标记免疫分析，特别是具有多种同形异构体的大分 子物质而言，目前的分析方法还很难得到真值，因此，还没有真正意 义上的“准确性评价”方法，目前通常是通过标准品核对实验或回收 率实验进行考察1.5.1 标准品核对实验：试剂盒内校准品与相应浓度的国际或国家 标准品同时进行分析测定，要求两条剂量－反应曲线不显著偏离平行 （t 测验），以国际或国家标准品为对照品，试剂盒内校准品的实测效 价与标示效价之比应在0・900~1・100之间标准品核对实验应注意：① 配制国际或国家标准品的稀释液应与试剂盒校准物质稀释液相 同，以保证两条剂量－反应曲线在相同反应体系下反应；② 配制国际或国家标准品的浓度范围应与试剂盒校准物质实际浓 度范围相当，以保证反应能在试剂盒工作范围内进行1・5・2 回收率实验1・5・2・1 添加回收率：选择经纯化、分析过的，性能稳定的已知高 浓度的抗原定量加入低浓度被测样本中，并进行分析测定，测定结果 与已知理论浓度相比较，应在90.0%〜110.0%范围内1・5・2・2 稀释回收率：同样选择经纯化、分析过的，性能稳定的已 知高浓度的抗原，按照一定比例稀释成系列溶液，并与试剂盒剂量－ 反应曲线同时测定，高浓度抗原系列与剂量－反应曲线相比较，应不 显著偏离平行（t测验），效价比应在0.900申1.100之间。

添加抗原溶液和稀释液同样应与试剂盒校准物质稀释液相同，以 保证反应在相同体系下进行注意：至少配制 3 个不同浓度添加到空白中的测试物，每一浓度 配制2份样品，每1 次试验对6份样品重复测定3次，比较测定值和真实值求出回收率（%），即偏差1.6 检测范匚二］range)剂量-反应曲线的工作范围（work in gra nge）是指能达到一定精密度、准确性和直线性时，测定方法适用的高低限度或量的区间，应使其最 精密的部分即曲线斜率最大的部分适合于临床测定需要的范围它既 可以包括全部正常范围（适合于高于和低于这个数值均有诊断意义的物 质，如血清胰岛素、地高辛测定），也可以在正常范围的一端（即低于或 者高于这个数值，不是两者均有诊断意义的物质，前者如血清雄烯二 酮测定，后者如血清肿瘤标志物分析）1.7高剂量钩变效应（HOOK效应）当标本中被测物浓度超过线性范围上界时，所得结果反而降低或 呈阴性，这种现象被形象地称为高剂量钩变效应（ HD-hookeffect） 由Miles等于1974年用双位点IRMA测血清铁蛋白时发现产生这 种现象的原因可以归纳为：在一步法试剂盒中是由于大量过剩抗原与 被捕获抗原竞争结合限量的标记二抗，二步法试剂盒与抗原的“质” （表位数量及其重复表达数量）有关。

固相捕捉抗体过量或有重复表 达表位的抗原，呈饱和结合，标记二抗与抗原交叉重叠结合，产生立 体效应，使抗原“异构”，与一抗的亲和力减弱洗涤时，标记二抗 体与抗原形成的复合物自固相脱离用高亲和力的单克。