质粒DNA的提取、定量、酶切与PCR鉴定实验报告.docx

与 PCR 鉴定创作：欧阳学时间：2021.03.03一、实验目的1. 学习并掌握用碱裂解法提取质粒 DNA 的方法；2. 学习并掌握了解质粒酶切鉴定的方法；3. 学习并掌握紫外吸收检测 DNA 浓度和纯度的原理和方 法；4. 学习并掌握 PCR 基因扩增的实验原理和操作方法；5. 学习并掌握水平式琼脂糖凝胶电泳的原理和使用方法二、实验原理1.PCR （多聚酶链式反应）在 DNA 聚合酶催化下，可以 DNA 为模板，以特定引物为 延伸起点，以 dNTP 为原料，通过变性、退火、延伸等步 骤，在体外（缓冲液中）复制 DNA，使目的 DNA 按2n 方式呈指数形式扩增PCR 一次循环的具体反应步骤为：A. 变性：加热反应系统至 95°C，使模板 DNA 在高温下完 全变性，双链解链 B. 退火：逐渐降低溶液温度，使合成引物在低温( 35 -70C,一般低于模板 Tm 值的5C左右)，与模板 DNA 互 补退火形成部分双链C. 延伸：溶液反应温度升至中温72C，在 Taq酶作用下， 以 dNTP 为原料，引物为复制起点，模板 DNA 的一条单 链在解链和退火之后延伸为一条双链2. 质粒DNA的提取与制备(1).碱裂解法：染色体 DNA 与质粒 DNA 的变性与复性存在差异：A. 高碱性条件下，染色体DNA和质粒DNA均变性；B. 当以高盐缓冲液调节其 pH 值至中性时，变性的质粒 DNA 复性并保存在溶液中，染色体 DNA 不能复性而形成 缠连的网状结构，可通过离心形成沉沉淀去除。

2).离心层析柱：A. 硅基质膜在高盐、低pH值状态下可选择性地结合溶液 中的质粒 DNA，而不吸附溶液中的蛋白质和多糖等物 质；B. 通过去蛋白液和漂洗液将杂质和其它细菌成分去除； C. 低盐，高pH 值的洗脱缓冲液将纯净质粒 DNA 从硅基质膜 上洗脱3. 质粒 DNA 的定量分析(紫外分光光度法)：A. 物质在光的照射下会产生对光的吸收效应，且其对光的吸收是具有选择性；B. 各种不同的物质都具有其各自的吸收光谱：DNA 分对波长 260nm 的紫外光有特异的吸收峰 蛋白质对波长 280nm 的紫外光有特异的吸收峰 碳水化合物对 230nm 的紫外光有特异的吸收峰C.A260/A280 及A260/A230 的比值可以反应 DNA 的纯度；A260/A280=1.8DNA 纯净A260/A280<1.8表示样品中含蛋白质（芳香族）或酚类物质A260/A280>1.8含 RNA 杂质，用 RNA 酶去除4.质粒 DNA 的酶切鉴定：限制性内切酶是DNA 重组操作过程中所使用的基本工具限制性内切酶能特异性地与一段被称为限制酶识别序 列的特殊 DNA 序列结合，或是与其附近的特异位点结 合，并在结合位点切割双链 DNA。

5.琼脂糖凝胶电泳： 琼脂糖是一种天然聚合长链状分子，可以形成具有刚性的 滤孔，凝胶孔径的大小决定于琼脂糖的浓度DNA 分子在碱性环境中带负电荷，在外加电场作用下向 正极泳动DNA 分子在琼脂糖凝胶中泳动时，有电荷效应与分子筛 效应：不同的 DNA，分子量大小及构型不同，电泳时的 泳动率就不同，从而分出不同的区带 （迁移速度与分子量 的对数值成反比关系 ）.三、材料与方法：（一）实验材料：1.PCR仪器： PCR 仪、台式离心机、微量加样枪、灭菌的薄壁离 心管材料：菌液【大肠杆菌 DH5a菌株（pMD19-T 质粒,含目的 片段-绿色荧光蛋白 GFP）】、无菌去离子水、 2xPremixTaq、弓 I 物2. 质粒 DNA 的提取与制备 仪器：恒温培养箱、台式离心机、离心层析柱、 Eppendorf 管、微量加样枪、离心管材料：溶液P1 （S1）、溶液P2 （S2）、溶液P3 （S3）、 去蛋白液 PE （W1）漂洗液 WB （W2）、洗脱液 EB （Eluent）、含pMD19-T质粒的大肠杆菌DH5 a3. 质粒DNA的定量（紫外分光光度法）仪器：比色杯、紫外分光光度计、微量加样枪材料：蒸馏水、质粒DNA4. 质粒DNA的酶切鉴定仪器：1.5ml的EP管、微量加样枪材料：无菌水、10xM 酶切缓冲液 Buf R、质粒 DNA、Hind III (15U/ul)、 EcoR I(12U/ul)5.琼脂糖凝胶电泳仪器：凝胶电泳系统、凝胶成像系统材 料 ： 电 泳指示剂 、 Gelview、 TBE、 琼脂 糖、 DNAMarker 5000、电泳缓冲液二)实验方法1.PCR准备目的DNA:菌液煮沸10min,冷冻，室温解冻后离心取上清液r k 、取0.2 ml PCR反应管一只，用微量加样枪按下述顺序分别加入：灭菌去离子水匕5.5卩1、2 —加入 500卩1去蛋白液(W1)，13000rpm离心 1min，弃滤液 :向吸附柱中加入700卩1漂洗液W2， 13000rpm离心1min，弃滤液；重复一遍PTemix将apCR5反应管置台式离心机L中瞬时离檄2 (10 mol/L) 1卩1、菌液丿2•质粒①雜预预提取与制备开始以下循环②循环为94°C――30秒，50°C~A30秒，72C——1分钟。

循环为30次③72°C 5分钟④4 C、保温V 取 1.5ml培养物加入 Eppendorf 管中 ——'13000rpm x 1min，弃上清―^―— 加入250 ul溶液S1，吹打，使细菌沉淀分散，彻底悬浮 加入250卩1溶液S2，颠倒4〜6次混匀(不要剧烈振荡)，直到溶液变得清——加入350卩1溶液S3，立即温和混匀 6~8次13000rpm离心10min，小心取上清液(50(将吸附柱放于f收集管中，将上一步所得上清V液加入吸附柱中，13000rpm离心甲说，弃滤液3.空柱13000rpm离心lmin,然后室温放置3min,使残留乙醇挥发50卩1洗脱缓冲液(Eluent)，室温放放置lmin, 13000rpm离心lmin洗脱质粒DNA,, _20°C保存备用 , 清洗比色皿：用微量加样枪向比色皿加入适 、 Y再向比色皿加入2ul的质粒DNA，于紫外分光4•质粒DNA的酶切鉴定厂 光度计上进行 'sample'测定，记录相关数据 在一个洁净的1.5mlEP管中按顺序依次加入下述试剂 无菌水9.0卩1、10xM酶切缓冲液 2.0卩1、质粒 DNA 7.0卩1、Hind iR (15U/ul) 1.0山、EcoR I (12U/ul) 1.0^15 •琼脂糖凝胶电泳昆匀试剂， 将EP管置于恒温水:谷箱中37C 1.5小］反应后的一DNA片段和―取质粒DNA、 ■^经往每个EP,管中加入1 uJGelview染料，室温放置一分钟 -用微量加样枪分别各吸取10ul,按序号加入到电泳仪的凝胶孔电泳30分钟四、结果与讨论:取出凝胶 紫外光下观察，拍照一)实验现象1. 加入溶液P1,出现悬浮现象；2. 加入溶液P2,温和混匀，溶液会变得清亮；3. 加入溶液P3,有白色絮状沉淀生成；4. 电泳时，可观察到在电流作用下，点样的溶液出现电泳 现象，电泳速度不同。

在紫外检测仪条件下，可以观察到不同的物质出现不同的 电泳带二）实验结果 原始实验数据测量次数 质粒DNA浓度（ug/ml） Ratio比值（A260/A280）1 1481.462 106 1.523 115 1.45平均值 123 1.47电泳后的图片（四）实验分析1. 由上数据可知，Ratio=1.47A260/A280<1.8 表明样品中含有较多的蛋白质（芳香族）2. 在图片中，其他三类 DNA 与 Maker 相比较，可知质粒 DNA 的 分子大小在 2500bp-3500bp ， 酶切反应的质粒 DNA 片段分子大小在 2800-3000bp 和 400-500 左右， PCR 的DNA分子大小在400-500bp基本符合预期四）实验讨论1. 质粒 DNA 中出现三条带，分别对应超螺旋质粒 DNA、 线性 DNA 和开环状质粒 DNA这三种不同构型的分子有 不同的迁移率，在一般情况下，迁移速度最快的为超螺旋 型，其次为线性分子，最慢的为开环状分子，所以条带从 上到下分别为：超螺旋型 DNA、线性分子、开环状分子 ,2. 对于实验结果中：A260/A280V1.8的可能原因为：A. 在质粒 DNA 的提取实验的 “取上清液” 步骤中吸入沉 淀导致引入较多的蛋白杂质，进而导致后续实验中因蛋白 质量较多而难以去除。

B. 可能为试剂污染引起杂质蛋白的引入3. 实验中需注意的事项： 用微量加样枪加试剂时，同种试剂可以不用换吸头，每次 换不同试剂时要记得换一个新吸头在 PCR 中，如果配好的反应液较多沾到管壁上，要将PCR 反应管置台式离心机中瞬时离心，使反应液集中于管 底，然后才将反应管放到基因扩增仪上在质粒 DNA 提取的实验中，加入溶液S2时，时间不能太 久，动作要温柔，轻轻颠倒几次在电泳实验中，点样时枪头下伸，点样孔内不能有气泡 在电泳中， Geldview 有毒，切勿用手接触思考题：（1 ）碱裂解法提取质粒时，溶液 I、II、III 的作用分别为？答：溶液I：螯合金属离子，抑制脱氧核酸酶对 DNA的降解作 用；有利于溶酶体的作用溶液 II:细胞壁肽聚糖在碱性下水解，核酸和蛋白质变性溶液III:酸性条件下质粒 DNA 复性，变性蛋白-SDS+线 性DNA沉淀，Na+可中和DNA2）结合实验情况，如何提高限制性酶切的反应效率？ 答:① 尽量选择粘端酶切和那些酶切效率高的限制酶② 酶量的选择任何时候 2 种酶的总量不能超过反应体系的1/10体积，而且最大反应体系最好不要小于20 ul，且酶切 反应中甘油浓度应低于 5%。

③ 底物 DNA 的纯度:主要污染 DNA 的某些物质，如酚、 氯仿、乙醇等均能抑制酶反应应尽量纯化底物④ 反应系统：主要是反应缓冲液中的离子强度，如 NaCl和 Mg2+, 合适离子强度可以激发酶切反应时间：2021.03.03创作：欧阳学。